Un dispositivo per test di attrito-bioreattore per lo studio della biomeccanica delle articolazioni sinoviali, della meccanobiologia e della regolazione fisica

Summary

Il presente protocollo descrive un dispositivo di prova di attrito che applica simultaneamente lo scorrimento reciproco e il carico normale a due controfasi biologiche a contatto.

Abstract

Nell’osteoartrite primaria (OA), la normale “usura” associata all’invecchiamento inibisce la capacità della cartilagine di sostenere le sue funzioni portanti e di lubrificazione, favorendo un ambiente fisico deleterio. Le interazioni di attrito della cartilagine articolare e della sinovia possono influenzare l’omeostasi articolare attraverso l’usura a livello tissutale e la meccanotrasduzione cellulare. Per studiare questi processi meccanici e meccanobiologici, viene descritto un dispositivo in grado di replicare il movimento dell’articolazione. Il dispositivo di prova di attrito controlla l’erogazione del movimento di traslazione reciproca e del carico normale a due controfasi biologiche a contatto. Questo studio adotta una configurazione sinovia su cartilagine e le misurazioni del coefficiente di attrito sono presentate per i test eseguiti in un bagno salino tamponato con fosfato (PBS) o liquido sinoviale (SF). Il test è stato eseguito per una serie di sollecitazioni di contatto, evidenziando le proprietà lubrificanti di SF sotto carichi elevati. Questo dispositivo di test di attrito può essere utilizzato come bioreattore biomimetico per studiare la regolazione fisica dei tessuti articolari viventi in risposta al carico fisiologico applicato associato all’articolazione dell’articolazione diartrodiale.

Introduction

L’osteoartrite (OA) è una malattia degenerativa debilitante che colpisce più di 32 milioni di adulti americani, con un costo sanitario e socio-economico di oltre $ 16,5 miliardi¹. La malattia è stata classicamente caratterizzata dalla degradazione della cartilagine articolare e dell’osso subcondrale; tuttavia, le modifiche alla sinovia hanno recentemente raccolto apprezzamento in quanto la sinovite è stata collegata ai sintomi dell’OA e alla progressione ^2,3,4. Nell’OA primaria (idiopatica), la normale “usura” associata all’invecchiamento inibisce la capacità della cartilagine di sostenere le sue funzioni portanti e di lubrificazione. Le sollecitazioni generate dal contatto di scorrimento prolungato degli strati di cartilagine articolare o dal contatto scorrevole della cartilagine contro i materiali dell’impianto hanno dimostrato di facilitare l’usura della delaminazione attraverso il fallimento della fatica del sottosuolo ^5,6. Poiché esiste un ambiente meccanico dinamico all’interno dell’articolazione ^7,8, le interazioni di attrito della cartilagine articolare e della sinovia possono influenzare l’omeostasi articolare attraverso l’usura a livello tissutale e la meccanotrasduzione cellulare. Per studiare questi processi meccanici e meccanobiologici, è stato progettato un dispositivo per replicare il moto dell’articolazione con stretto controllo sul carico compressivo e frizionale 5,6,9,10,11,12,13.

Il presente protocollo descrive un dispositivo di test di attrito che fornisce reciproco, traducendo il movimento e il carico compressivo alle superfici di contatto degli espianti di tessuti viventi. Il dispositivo controllato dal computer consente all’utente di controllare la durata di ogni prova, il carico applicato, l’intervallo di movimento della fase di traslazione e la velocità di traduzione. Il dispositivo è modulare, consentendo di testare varie controfasi, come tessuto su tessuto (cartilagine su cartilagine e sinovia su cartilagine) e tessuto su vetro. Oltre alle misurazioni funzionali ottenute dal tester, i componenti tissutali e del bagno lubrificante possono essere valutati prima e dopo i test per valutare i cambiamenti biologici impartiti da un determinato regime sperimentale.

Gli studi di tribologia della cartilagine sono stati eseguiti per decenni e sono state sviluppate diverse tecniche per misurare i coefficienti di attrito tra cartilagine e vetro e cartilagine sulla cartilagine^14,15. I diversi approcci sono motivati dal giunto e/o dal meccanismo di lubrificazione di interesse. C’è spesso un compromesso tra il controllo delle variabili sperimentali e la ricapitolazione dei parametri fisiologici. I dispositivi a pendolo utilizzano giunti intatti come fulcro di un semplice pendolo in cui una superficie articolare si traduce liberamente sulla seconda superficie 14,16,17,18. Invece di utilizzare giunti intatti, le misure di attrito possono essere ottenute facendo scorrere gli espianti di cartilagine sulle superfici desiderate 14,19,20,21,22,23,24,25. I coefficienti di attrito riportati della cartilagine articolare sono variati in un ampio intervallo (da 0,002 a 0,5) a seconda delle condizioni operative^14,26. Sono stati creati dispositivi per replicare il movimento rotatorio 23,27,28. Gleghorn et ^al.26 hanno sviluppato un tribometro multi-pozzo personalizzato per osservare i profili di lubrificazione della cartilagine utilizzando l’analisi della curva di Stribeck e un movimento di scorrimento oscillatorio lineare è stato applicato tra la cartilagine contro una controfacciata in vetro piano.

Questo dispositivo mira a isolare le risposte di attrito ed esplorare la meccanobiologia dei tessuti viventi in varie condizioni di carico. Il dispositivo utilizza una configurazione di prova semplificata che simula l’articolazione articolare attraverso lo scorrimento compressivo, che può approssimare sia il movimento di rotolamento che quello di scorrimento con la consapevolezza che la resistenza nel movimento di rotolamento puro è trascurabile rispetto al coefficiente di attrito misurato della cartilagine articolare²⁹. Originariamente costruito per studiare gli effetti della pressurizzazione del liquido interstiziale sulla risposta di attrito della cartilagine articolare⁹, il tester è stato utilizzato per esplorare argomenti quali gli effetti di attrito della rimozione della zona superficiale della cartilagine¹⁰, gli effetti lubrificanti del liquido sinoviale¹¹, le ipotesi di usura della cartilagine ^5,6,30 e le misurazioni dell’attrito sinovia-su-tessuto¹³ . Il bioreattore per test di attrito può condurre esperimenti di attrito in condizioni sterili, fornendo un nuovo meccanismo per esplorare come le forze di attrito influenzano le risposte meccanobiologiche della cartilagine vivente e della sinovia. Questo progetto può essere utilizzato come bioreattore biomimetico per studiare la regolazione fisica dei tessuti articolari viventi in risposta al carico fisiologico applicato associato all’articolazione dell’articolazione diartrodiale.

Questo studio presenta una configurazione per il test di attrito sinovia-su-cartilagine su una gamma di sollecitazioni di contatto e in diversi bagni di lubrificazione. La superficie articolata della maggior parte delle articolazioni è, in larga misura, tessuto sinoviale³¹. Mentre lo scorrimento della sinovia sulla cartilagine non si verifica sulle superfici portanti primarie, le interazioni di attrito tra i due tessuti possono ancora avere importanti implicazioni per la riparazione a livello tissutale e la meccanotrasduzione cellulare. In precedenza è stato dimostrato che i sinoviociti fibroblasti-simili (FLS) che risiedono sullo strato intimale della sinovia sono meccanosensibili, rispondendo allo stress di taglio indotto dai liquidi³². È stato anche dimostrato che lo stretch^33,34 e lo sforzo di taglio indotto dal fluido³⁵ modulano la produzione di lubrificante FLS. Pertanto, il contatto diretto scorrevole tra sinovia e cartilagine può fornire un altro stimolo meccanico alle cellule residenti nella sinovia.

Solo pochi rapporti sui coefficienti di attrito sinovo sono stati pubblicati^31,36. Estell et ^al.13 hanno cercato di espandere la caratterizzazione precedente utilizzando controfasi biologicamente rilevanti. Con la capacità del dispositivo di test di attrito di testare i tessuti viventi, è possibile imitare le interazioni fisiologiche dei tessuti durante l’articolazione articolare per chiarire il ruolo dello stress da taglio da contatto sulla funzione dei sinoviociti e il suo contributo alla diafonia tra sinovia e cartilagine. Quest’ultimo è stato implicato nella mediazione dell’infiammazione dell’articolazione sinoviale nell’artrite e nel post-infortunio. A causa della vicinanza fisica della cartilagine alla sinovia e al liquido sinoviale, che contengono sinoviociti che presentano capacità multipotente, compresa la condrogenesi, si ipotizza che i sinoviociti svolgano un ruolo nell’omeostasi e nella riparazione della cartilagine attecchindosi alla superficie articolare. In questo contesto, il contatto fisico e la tranciatura reciproca della cartilagine-sinovia e della sinovia-sinovia possono aumentare l’accessibilità dei sinoviociti alle regioni del danno cartilagineo 37,38,39,40. Gli studi che utilizzano configurazioni sinovia su cartilagine non solo forniranno approfondimenti sulla meccanica e la tribologia del tessuto grossolano articolare, ma possono anche portare a nuove strategie per mantenere la salute delle articolazioni.

Protocol

Per il presente studio sono state utilizzate le articolazioni giovanili del ginocchio bovino, ottenute da un macello locale. Gli studi con tali campioni di campioni di bovini sono esentati dal Columbia Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Progettazione del dispositivo di prova di attrito NOTA: nella Figura 1 è illustrata una rappresentazione schematica del dispositivo di prova di attrito. Il dispositiv…

Representative Results

Una configurazione sinovia su cartilagine è stata utilizzata per testare ad attrito gli espianti bovini giovani. La sinovia è stata montata su una piastra di carico acrilica di 10 mm di diametro in modo tale che lo strato intimale fosse a contatto con la cartilagine sottostante. Una striscia tibiale è stata usata come controfacciata della cartilagine (Figura 6A). Le strisce tibiali sono state tagliate con una profondità di circa 1,4 mm e una dimensione di 10 mm x 30 mm. I campioni sono s…

Discussion

Esiste un ambiente meccanico dinamico all’interno dell’articolazione in quanto la cartilagine è sottoposta a forze di compressione, trazione e taglio e pressioni idrostatiche e osmotiche^44,45. Sebbene la cartilagine sia il principale tessuto portante dell’articolazione, la sinovia subisce anche interazioni di attrito con la superficie della cartilagine e con se stessa nelle regioni in cui il tessuto si piega. Le interazioni fisiche tra cartilagine e sinovia sono…

Materials

Aluminum foil	Reynolds Group Holdings	Reynolds Wrap	Sterile tissue harvest
Aluminum-framed acrylic enclosure	Custom made		Friction tester component
Autoclavable instant sealing sterilization pouches	Fisherbrand	01-812-54	Sterilization of tools
Autoclave	Buxton		Sterilization of tools
Beaker (250 mL)	Pyrex Vista	70000	Tissue harvest
Betadine (Povidone Iodine Prep Solution)	Medline Industries, LP	MDS093906	Sterile tissue harvest
Biological safety cabinet	Labconco	Purifier Logic+ Class II, Type A2 BSC	Sterile tissue harvest
Biospy punch	Steritool Inc.	50162	Tissue harvest
Box cutter	American Safety Razor Company	94-120-71	Tissue harvest
Circular acrylic-sillicone post (synovium)	Custom made		Tissue mounting
Culture media	Custom made		DMEM (Cat No. 11-965-118; Gibco) supplemented with 50 μg/mL L-proline (Cat. No. P5607; Sigma), 100 μg/mL sodium pyruvate (Cat. No. S8636; Sigma), 1% ITS (Cat. No. 354350; Corning), and 1% antibiotic–antimycotic (Cat. No. 15-240-062, Gibco)
Cyanoacrylate (Loctite 420 Clear)	Henkel	135455	Tissue mounting
Dead weights	OHAUS		Normal load
Ethanol 200 proof	Decon Labs, Inc.	2701	Dilute to 70 %
Fixed base	ThorLabs, Inc.	SB1T	Friction tester component
Forceps (synovium harvest)	Fine Science Tools	11019-12	Tissue harvest
Forceps (synovium mounting)	Excelta	3C-S-PI	Tissue mounting
Horizontal linear encoder (for translating stage)	RSF Electronics, Inc.	MSA 670.63	Friction tester component; system resolution of 1 µm
Hot glue gun and glue	FPC Corporation	Surebonder Pro 4000A	Tissue mounting
LabVIEW	National Instruments Corporation	LabVIEW  2010	Friction testing program
Load cell	JR3 Inc.	20E12A-M25B	Friction tester component; 0.0019 lbs resolution in x&y, 0.0038 lbs resolution in z
Loading platen	Custom made		Tissue mounting
O-ring	Parker	S1138AS568-009	Tissue mounting
Petri dish (60 mm)	Falcon	351007	Tissue mounting
PivotLok Work Positioner (tibia holder)	Industry Depot, Pivot Lok	PL325	Tissue harvest
Removable base	ThorLabs, Inc.	SB1B	Friction tester component
Ring stand			Tissue harvest
Scalpel blades	Havel's Inc.	FSC22	Tissue harvest
Scalpel handle	FEATHER Safety Razor Co., Ltd.	No. 4	Tissue harvest
Screwdriver	Wera	3334	Tissue harvest
Stage	JMAR		Friction tester component
Stepper motor	Oriental Motor Co., Ltd.	PK266-03B	Friction tester component
Suction tool	Virtual Industries, Inc.	PEN-VAC Vacuum Pen	Tissue mounting
Support rod	Custom made		Tissue mounting
Surgical scissors	Fine Science Tools	14061-09	Tissue mounting
Synovial fluid (bovine)	Animal Technologies, Inc.		Friction testing bath
Testing bath	Custom made		Phosphate-Buffered Saline (PBS) with protease inhibitors: 0.04% isothiazolone-base biocide (Proclin 950 Cat. No. 46878-U; Sigma) and 0.1% protease inhibitor – 0.05 M ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA (Cat. No. 0369; Sigma)
Tissue culture incubator	Fisher Scientific	Isotemp	Sterile culture
Vertical linear encoder (for loading stage)	Renishaw	T1031-30A	Friction tester component; 20 nm resolution
Voice coil actuator	H2W Technologies	NCC20-15-027-1RC	Friction tester component