セプチンの超微細構造組織、膜再形成、および曲率感度挙動をアッセイするためのボトムアップ インビトロ 法
Summary
セプチンは細胞骨格タンパク質である。それらは脂質膜と相互作用し、ミクロンスケールで膜曲率を感知するだけでなく生成することもできる。このプロトコルでは、膜変形、曲率に敏感なセプチン結合、およびセプチンフィラメントの超構造を分析するためのボトムアップ インビトロ 方法論について説明します。
Abstract
膜リモデリングは、原形質膜および細胞小器官内で絶えず起こる。環境(イオン条件、タンパク質および脂質組成、膜曲率)と特定の膜再形成プロセスに関連するさまざまなパートナーの役割を完全に解剖するために、in vitro ボトムアップアプローチを実施します。近年、主要な疾患に関連するセプチンタンパク質の役割を明らかにすることに強い関心が寄せられている。セプチンは、原形質膜と相互作用する必須かつ遍在する細胞骨格タンパク質である。それらは、細胞分裂、細胞運動性、神経形態形成、および精子形成、他の機能の中でも特に関与している。したがって、セプチンが膜でどのように相互作用し、組織化してその後膜変形を誘発するか、およびセプチンが特定の膜曲率にどのように敏感であるかを理解することが重要です。本稿は、分子レベルでのセプチンの超構造とミクロンスケールで起こる膜リモデリングとの相互作用を解読することを目的としている。この目的のために、出芽酵母、および哺乳動物セプチン複合体を組換え発現および精製した。次いで、 インビトロ アッセイの組み合わせを用いて、膜におけるセプチンの自己組織化を分析した。支持脂質二重層(SLB)、巨大な単層小胞(GUV)、大きな単層小胞(LUV)、および波状基質を用いて、セプチン自己組織化、膜再形成、および膜曲率の間の相互作用を研究した。
Introduction
セプチンは、脂質膜と相互作用する細胞骨格フィラメント形成タンパク質である。セプチンは真核生物に遍在しており、多数の細胞機能に不可欠です。それらは、出芽酵母および哺乳動物における細胞分裂の主要な調節因子として同定されている1,2。それらは、膜再形成事象、繊毛形成3、および精子形成4に関与している。哺乳動物細胞内では、セプチンはまた、Rho GTPases(BORG)依存的に結合剤であるアクチンおよび微小管5、6、7と相互作用し得る8。様々な組織(ニューロン9、繊毛3、精子10)において、セプチンは、膜結合成分11に対する拡散障壁の調節因子として同定されている。セプチンはまた、膜ブレビングおよび突出形成12を調節することが示されている。セプチンはマルチタスクタンパク質であり、様々な流行疾患の出現に関与している13。それらの誤った調節は、癌14および神経変性疾患15の出現と関連している。
生物に応じて、いくつかのセプチンサブユニット(Caenorhabditis elegansでは2つ、ヒトでは13個)が集合して複合体を形成し、その組織は組織依存的に変化する16。基本的なセプチンビルディングブロックは、2〜4つのサブユニットを収集し、2つのコピーで存在し、棒状の回文様式で自己組織化する。出芽酵母において、セプチンは八量体17,18である。その場で、セプチンはしばしばマイクロメートル曲率を有する部位に局在する。それらは分裂狭窄部位、繊毛および樹状突起の基部、および精子の環状で見出される19,20。膜では、セプチンの役割は二重であるように思われる:それらは脂質二重層を再形成し、膜の完全性を維持することに関与している21。したがって、膜におけるセプチンフィラメント形成タンパク質および/またはサブユニットの生物物理学的特性を調査することは、それらの役割を理解するために極めて重要である。十分に制御された環境におけるセプチンの特定の特性を解剖するためには、ボトムアップのインビトロアプローチが適切である。これまでのところ、インビトロでのセプチンの生物物理学的特性を記載しているのはごく少数のグループのみである20、22、23。したがって、他の細胞骨格フィラメントと比較して、インビトロでのセプチンの挙動に関する現在の知識は限られたままである。
このプロトコルは、セプチンフィラメントの組織化、膜の再形成、および曲率感度を分析する方法を説明しています19。この目的のために、光学および電子顕微鏡法(蛍光顕微鏡法、クライオ電子顕微鏡[クライオEM]、および走査型電子顕微鏡[SEM])の組み合わせが使用されてきた。マイクロメートルサイズの巨大な単層小胞(GUV)の膜再形成は、蛍光光学顕微鏡を用いて可視化される。脂質小胞に結合したセプチンフィラメントの配置および超構造の解析は、クライオEMを用いて行われる。セピン曲率感度の解析はSEMを用いて行われ、可変曲率の波状基板上に堆積した固体支持脂質二重層に結合したセプチンフィラメントの挙動を研究することにより、正と負の両方の曲率感度の解析が可能になります。以前の解析20,24と比較して、ここでは、セプチンがどのように自己集合し、相乗的に膜を変形し、曲率に敏感であるかを徹底的に分析するために、これらの方法の組み合わせを使用することを提案します。このプロトコールは、膜に対して親和性を示す任意の糸状タンパク質に有用かつ適応可能であると考えられている。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のように、脂質二重層内のPI(4,5)P2 の取り込みを増強し、したがってセプチン – 膜相互作用を促進する脂質混合物が使用されている。実際、我々は、出芽酵母セプチンがPI(4,5 )P 2特異的な様式で小胞と相互作用することを他の25で示した。この脂質組成物は、複数の組成物をスクリーニングすることから経験的に調整され、現在、著者らによって広く使用?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Patricia Bassereau と Daniel Lévy の有益なアドバイスと議論に感謝します。この作業は、プロジェクト「SEPTIME」、ANR-13-JSV8-0002-01、ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014、およびプロジェクト「SEPTSCORT」(ANR-20-CE11-0014-01)に資金を提供するためのANR(Agence Nationale de la Recherche)の支援の恩恵を受けました。B. ショーヴァンは、エコール・ドクターラーレ「ED564: Physique en Ile de France」とFondation pour lea Recherche Médicaleから資金提供を受けています。中澤圭吾はソルボンヌ大学(AAP Emergence)の支援を受けた。G.H. Koenderinkは、Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek(NWO/OCW)の「BaSyC-Building a Synthetic Cell」を通じて支援を受けた。重力グラント(024.003.019).Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) と Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02) に感謝します。我々は、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーである細胞組織イメージング(PICT-IBiSA)、Institut Curieに感謝します。
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
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