Bottom-up in vitro-metoder til analyse af den ultrastrukturelle organisation, membranomformning og krumningsfølsomhedsadfærd hos septiner
Summary
Septiner er cytoskeletale proteiner. De interagerer med lipidmembraner og kan fornemme, men også generere membrankrumning på mikronskala. Vi beskriver i denne protokol bottom-up in vitro-metoder til analyse af membrandeformationer, krumningsfølsom septinbinding og septinfilament ultrastruktur.
Abstract
Membranombygning forekommer konstant ved plasmamembranen og inden for cellulære organeller. For fuldt ud at dissekere miljøets rolle (ioniske tilstande, protein- og lipidsammensætninger, membrankrumning) og de forskellige partnere, der er forbundet med specifikke membranomformningsprocesser, foretager vi in vitro bottom-up-tilgange. I de senere år har der været stor interesse for at afsløre septinproteinernes rolle forbundet med større sygdomme. Septiner er essentielle og allestedsnærværende cytoskeletale proteiner, der interagerer med plasmamembranen. De er impliceret i celledeling, cellemotilitet, neuromorfogenese og spermiogenese, blandt andre funktioner. Det er derfor vigtigt at forstå, hvordan septiner interagerer og organiserer sig ved membraner for efterfølgende at inducere membrandeformationer, og hvordan de kan være følsomme over for specifikke membrankrumninger. Denne artikel har til formål at dechiffrere samspillet mellem ultrastrukturen af septiner på molekylært niveau og membranombygningen, der forekommer på mikronskala. Til dette formål blev spirende gær og pattedyrs septinkomplekser rekombinant udtrykt og renset. En kombination af in vitro-assays blev derefter brugt til at analysere selvmonteringen af septiner ved membranen. Understøttede lipiddobbeltlag (SLB’er), gigantiske unilamellare vesikler (GUV’er), store unilamellare vesikler (LUV’er) og bølgede substrater blev brugt til at studere samspillet mellem septin selvsamling, membranomformning og membrankrumning.
Introduction
Septiner er cytoskeletale filamentdannende proteiner, der interagerer med lipidmembraner. Septiner er allestedsnærværende i eukaryoter og afgørende for mange cellulære funktioner. De er blevet identificeret som de vigtigste regulatorer for celledeling i spirende gær og pattedyr 1,2. De er involveret i membranomformningshændelser, ciliogenese3 og spermiogenese4. Inden for pattedyrceller kan septiner også interagere med actin og mikrotubuli 5,6,7 i et bindemiddel af Rho GTPases (BORG) -afhængig måde8. I forskellige væv (neuroner9, cilia3, spermatozoer10) er septiner blevet identificeret som regulatorer af diffusionsbarrierer for membranbundne komponenter11. Septiner har også vist sig at regulere membranblegning og fremspringsdannelse12. Septiner, der er multi-tasking proteiner, er impliceret i fremkomsten af forskellige udbredte sygdomme13. Deres fejlregulering er forbundet med fremkomsten af kræft14 og neurodegenerative sygdomme15.
Afhængigt af organismen samles flere septinunderenheder (to i Caenorhabditis elegans til 13 hos mennesker) for at danne komplekser, hvis organisation varierer på en vævsafhængig måde16. Den grundlæggende septinbyggesten samler to til fire underenheder, der er til stede i to kopier og selvsamlede på en stanglignende palindromisk måde. I spirende gær er septineroktomere 17,18. In situ er septiner ofte lokaliseret på steder med mikrometerkrumning; de findes ved opdelingsforsnævringssteder, ved bunden af cilia og dendritter og ved ring af spermatozoer19,20. Ved membranen synes septinernes rolle at være dobbelt: de er impliceret i omformning af lipiddobbeltlaget og opretholdelse af membranintegritet21. Derfor er det afgørende at undersøge de biofysiske egenskaber af septinfilamentdannende proteiner og / eller underenheder ved membranen for at forstå deres rolle. For at dissekere septiners specifikke egenskaber i et velkontrolleret miljø er bottom-up in vitro-tilgange hensigtsmæssige. Indtil videre har kun få grupper beskrevet de biofysiske egenskaber af septiner in vitro 20,22,23. Sammenlignet med andre cytoskeletale filamenter forbliver den nuværende viden om septiners opførsel in vitro derfor begrænset.
Denne protokol beskriver, hvordan organiseringen af septinfilamenter, membranomformning og krumningsfølsomhed kan analyseres19. Til dette formål er der anvendt en kombination af optiske og elektronmikroskopimetoder (fluorescensmikroskopi, kryo-elektronmikroskopi [cryo-EM] og scanningselektronmikroskopi [SEM]). Membranomformningen af mikrometerstore gigantiske unilamellare vesikler (GUV’er) visualiseres ved hjælp af fluorescensoptisk mikroskopi. Analysen af arrangementet og ultrastrukturen af septinfilamenter bundet til lipidvesikler udføres ved anvendelse af cryo-EM. Analyse af septinkrumningsfølsomhed udføres ved hjælp af SEM ved at studere opførelsen af septinfilamenter bundet til fastunderstøttede lipiddobbeltlag deponeret på bølgede substrater af variable krumninger, hvilket muliggør analyse af krumningsfølsomhed for både positive og negative krumninger. Sammenlignet med tidligere analyse20,24 foreslår vi her at bruge en kombination af metoder til grundigt at analysere, hvordan septiner kan samle sig selv, synergistisk deformere membran og være krumningsfølsomme. Denne protokol menes at være nyttig og tilpasningsdygtig til ethvert trådformet protein, der viser en affinitet for membraner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som nævnt ovenfor er der anvendt en lipidblanding, der forbedrer PI (4,5) P 2-inkorporering i lipiddobbeltlaget og letter dermed septin-membraninteraktioner. Faktisk har vi vist andetsteds25, at spirende gærseptiner interagerer med vesikler på en PI (4,5) P2-specifik måde. Denne lipidsammensætning blev justeret empirisk fra screening af flere sammensætninger og anvendes nu i vid udstrækning af forfatterne. PI(4,5)P2 lipider skal håndteres omhyggeligt. Stamo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Patricia Bassereau og Daniel Lévy for deres nyttige råd og diskussioner. Dette arbejde modtog støtte fra ANR (Agence Nationale de la Recherche) til finansiering af projektet “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 og projektet “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin er finansieret af Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” og Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa blev støttet af Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink blev støttet af Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) gennem »BaSyC-Building a Synthetic Cell«. Gravitationstilskud (024.003.019). Vi takker Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) og Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Vi takker Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Referências
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
