नीचे-ऊपर कृत्रिम परिवेशीय तरीके अल्ट्रास्ट्रक्चरल संगठन, झिल्ली रीशेपिंग, और सेप्टिन के वक्रता संवेदनशीलता व्यवहार परख करने के लिए
Summary
सेप्टिन साइटोस्केलेटल प्रोटीन हैं। वे लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं और समझ सकते हैं लेकिन माइक्रोन पैमाने पर झिल्ली वक्रता भी उत्पन्न कर सकते हैं। हम झिल्ली विकृतियों, वक्रता-संवेदनशील सेप्टिन बाइंडिंग और सेप्टिन फिलामेंट अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए इन विट्रो पद्धतियों में इस प्रोटोकॉल में नीचे-ऊपर का वर्णन करते हैं।
Abstract
झिल्ली रीमॉडेलिंग प्लाज्मा झिल्ली पर और सेलुलर ऑर्गेनेल के भीतर लगातार होती है। पर्यावरण (आयनिक स्थितियों, प्रोटीन और लिपिड रचनाओं, झिल्ली वक्रता) और विशिष्ट झिल्ली रीशेपिंग प्रक्रियाओं से जुड़े विभिन्न भागीदारों की भूमिका को पूरी तरह से विच्छेदित करने के लिए, हम इन विट्रो बॉटम-अप दृष्टिकोण करते हैं। हाल के वर्षों में, प्रमुख बीमारियों से जुड़े सेप्टिन प्रोटीन की भूमिका का खुलासा करने में गहरी रुचि रही है। सेप्टिन आवश्यक और सर्वव्यापी साइटोस्केलेटल प्रोटीन हैं जो प्लाज्मा झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं। वे अन्य कार्यों के बीच कोशिका विभाजन, कोशिका गतिशीलता, न्यूरो-मॉर्फोजेनेसिस और शुक्राणुजनन में फंस गए हैं। इसलिए, यह समझना महत्वपूर्ण है कि सेप्टिन झिल्ली पर कैसे बातचीत करते हैं और बाद में झिल्ली विकृतियों को प्रेरित करते हैं और वे विशिष्ट झिल्ली वक्रता के प्रति संवेदनशील कैसे हो सकते हैं। इस लेख का उद्देश्य आणविक स्तर पर सेप्टिन की अल्ट्रा-संरचना और माइक्रोन पैमाने पर होने वाली झिल्ली रीमॉडेलिंग के बीच परस्पर क्रिया को समझना है। इसके लिए, नवोदित खमीर, और स्तनधारी सेप्टिन परिसरों को पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध किया गया था। इन विट्रो परखों का एक संयोजन तब झिल्ली पर सेप्टिन की आत्म-असेंबली का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया था। समर्थित लिपिड बाइलेयर (एसएलबी), विशाल यूनिलामेलर पुटिकाएं (जीयूवी), बड़े यूनिलामेलर पुटिकाएं (एलयूवी), और लहराती सब्सट्रेट का उपयोग सेप्टिन स्व-असेंबली, झिल्ली रीशेपिंग और झिल्ली वक्रता के बीच परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए किया गया था।
Introduction
सेप्टिन साइटोस्केलेटल फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन हैं जो लिपिड झिल्ली के साथ बातचीत करते हैं। सेप्टिन यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी हैं और कई सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक हैं। उन्हें नवोदित खमीर और स्तनधारियों 1,2 में कोशिका विभाजन के मुख्य नियामकों के रूप में पहचाना गया है। वे झिल्ली रीशेपिंग घटनाओं, सिलियोजेनेसिस3 और शुक्राणुजनन4 में शामिल हैं। स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर, सेप्टिन आरएचओ जीटीपीस (बीओआरजी) –निर्भर तरीके से एक बांधने की मशीन में एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं 5,6,7 के साथ भी बातचीत कर सकते हैं। विभिन्न ऊतकों (न्यूरॉन्स9, सिलिया3, शुक्राणुजोज़ा10) में, सेप्टिन को झिल्ली-बाध्य घटकों11 के लिए प्रसार बाधाओं के नियामकों के रूप में पहचाना गया है। सेप्टिन को झिल्ली ब्लीबिंग और फलाव गठन को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है12. सेप्टिन, मल्टी-टास्किंग प्रोटीन होने के नाते, विभिन्न प्रचलित बीमारियों के उद्भव में फंस गए हैं13. उनका मिसरेगुलेशन कैंसर14 और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के उद्भव से जुड़ा हुआ है15.
जीव के आधार पर, कई सेप्टिन सबयूनिट्स (मनुष्यों में 13 केनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में दो) कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए इकट्ठा होते हैं जिनका संगठन ऊतक-निर्भर फैशन16 में भिन्न होता है। मूल सेप्टिन बिल्डिंग ब्लॉक दो से चार सबयूनिट्स को इकट्ठा करता है, जो दो प्रतियों में मौजूद होते हैं और रॉड जैसे पैलिंड्रोमिक तरीके से स्व-इकट्ठे होते हैं। नवोदित खमीर में, सेप्टिन ऑक्टामेरिक17,18 होते हैं। सीटू में, सेप्टिन को अक्सर माइक्रोमीटर वक्रता वाली साइटों पर स्थानीयकृत किया जाता है; वे विभाजन कसना स्थलों पर, सिलिया और डेंड्राइट्स के आधार पर, और शुक्राणुजोज़ा19,20 के वार्षिकी पर पाए जाते हैं। झिल्ली पर, सेप्टिन की भूमिका दोहरी प्रतीत होती है: वे लिपिड बाइलेयर को फिर से आकार देने और झिल्ली अखंडता को बनाए रखने में फंस गए हैं21. इसलिए, झिल्ली पर सेप्टिन फिलामेंट बनाने वाले प्रोटीन और / या सबयूनिट्स के बायोफिजिकल गुणों की जांच करना उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में सेप्टिन के विशिष्ट गुणों को विच्छेदित करने के लिए, इन विट्रो दृष्टिकोण में नीचे-ऊपर उपयुक्त हैं। अब तक, केवल कुछ समूहों ने इन विट्रो20,22,23 में सेप्टिन के बायोफिजिकल गुणों का वर्णन किया है। इसलिए, अन्य साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स की तुलना में, इन विट्रो में सेप्टिन के व्यवहार पर वर्तमान ज्ञान सीमित रहता है।
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि सेप्टिन फिलामेंट्स, झिल्ली रीशेपिंग और वक्रता संवेदनशीलता के संगठन का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है19. इसके लिए, ऑप्टिकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [क्रायो-ईएम], और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [एसईएम]) के संयोजन का उपयोग किया गया है। माइक्रोमीटर के आकार के विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) की झिल्ली को प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जाती है। लिपिड पुटिकाओं से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स की व्यवस्था और अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण क्रायो-ईएम का उपयोग करके किया जाता है। सेप्टिन वक्रता संवेदनशीलता का विश्लेषण एसईएम का उपयोग करके किया जाता है, चर वक्रता के लहराती सब्सट्रेट पर जमा ठोस समर्थित लिपिड बाइलेयर से बंधे सेप्टिन फिलामेंट्स के व्यवहार का अध्ययन करके, जो सकारात्मक और नकारात्मक वक्रता दोनों के लिए वक्रता संवेदनशीलता के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। पिछले विश्लेषण20,24 की तुलना में, यहां, हम अच्छी तरह से विश्लेषण करने के लिए तरीकों के संयोजन का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं कि सेप्टिन कैसे आत्म-इकट्ठा हो सकते हैं, सहक्रियात्मक रूप से झिल्ली को विकृत कर सकते हैं, और वक्रता-संवेदनशील हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल को झिल्ली के लिए एक आत्मीयता प्रदर्शित करता है कि किसी भी फिलामेंटस प्रोटीन के लिए उपयोगी और अनुकूलनीय माना जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि ऊपर कहा गया है, एक लिपिड मिश्रण का उपयोग किया गया है जो लिपिड बाइलेयर के भीतर पीआई (4,5) पी2 निगमन को बढ़ाता है और इस प्रकार सेप्टिन-झिल्ली इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करता है। दरअसल, हमने कहीं और<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पेट्रीसिया बसेरो और डैनियल लेवी को उनकी उपयोगी सलाह और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं। यह काम परियोजना “सेपटाइम”, एएनआर -13-जेएसवी 8-0002-01, एएनआर सेप्टिमोआरएफ एएनआर-17-सीई 13-0014, और परियोजना “सेप्टस्कॉर्ट”, एएनआर -20-सीई 11-0014-01 के वित्तपोषण के लिए एएनआर (एजेंस नेशनले डे ला रेचेर्चे) के समर्थन से लाभान्वित हुआ। चौविन को इकोल डॉक्टरेट “ईडी 564: फिजिक एन इले डी फ्रांस” और फोंडेशन पोर ली रेचेर्चे मेडिकेल द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। के नाकाजावा द्वारा समर्थित था सोरबोन यूनिवर्सिटी (एएपी उद्भव)। जीएच कोएंडरिंक को नेडरलैंड्स ऑर्गेनाइजेशन वूर वेटेंस्चैपेलिजक ओन्डरज़ोक (एनडब्ल्यूओ / ओसीडब्ल्यू) द्वारा ‘बेसीक-बिल्डिंग ए सिंथेटिक सेल’ के माध्यम से समर्थित किया गया था। गुरुत्वाकर्षण अनुदान (024.003.019)। हम लैबेक्स सेल (एन) स्केल (एएनआर -11-लैबएक्स 0038) और पेरिस साइंसेज एट लेट्रेस (एएनआर -10-आईडीईएक्स-0001-02) का धन्यवाद करते हैं। हम सेल और ऊतक इमेजिंग (पीआईसीटी-आईबीआईएसए), इंस्टीट्यूट क्यूरी, फ्रेंच नेशनल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फ्रांस-बायोइमेजिंग (एएनआर 10-आईएनबीएस -04) के सदस्य का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Referências
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
