Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine
Summary
Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l’analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell’ultrastruttura del filamento di settino.
Abstract
Il rimodellamento della membrana avviene costantemente a livello della membrana plasmatica e all’interno degli organelli cellulari. Per analizzare completamente il ruolo dell’ambiente (condizioni ioniche, composizioni proteiche e lipidiche, curvatura della membrana) e dei diversi partner associati a specifici processi di rimodellamento della membrana, intraprendiamo approcci bottom-up in vitro . Negli ultimi anni, c’è stato un vivo interesse nel rivelare il ruolo delle proteine della settina associate alle principali malattie. Le settine sono proteine citoscheletriche essenziali e ubiquitarie che interagiscono con la membrana plasmatica. Sono implicati nella divisione cellulare, nella motilità cellulare, nella neuro-morfogenesi e nella spermiogenesi, tra le altre funzioni. È quindi importante capire come le settine interagiscono e si organizzano a livello delle membrane per indurre successivamente deformazioni di membrana e come possono essere sensibili a specifiche curvature di membrana. Questo articolo mira a decifrare l’interazione tra l’ultra-struttura delle settine a livello molecolare e il rimodellamento della membrana che avviene su scala micron. A tal fine, il lievito in erba e i complessi di septina dei mammiferi sono stati espressi e purificati in modo ricombinante. Una combinazione di saggi in vitro è stata quindi utilizzata per analizzare l’autoassemblaggio delle settine sulla membrana. Sono stati utilizzati doppi strati lipidici supportati (SLB), vescicole unilamellari giganti (GUV), grandi vescicole unilamellari (LUV) e substrati ondulati per studiare l’interazione tra auto-assemblaggio della settina, rimodellamento della membrana e curvatura della membrana.
Introduction
Le settine sono proteine che formano filamenti citoscheletrici che interagiscono con le membrane lipidiche. Le settine sono onnipresenti negli eucarioti ed essenziali per numerose funzioni cellulari. Sono stati identificati come i principali regolatori della divisione cellulare nei lieviti in erba e nei mammiferi 1,2. Sono coinvolti negli eventi di rimodellamento della membrana, nella ciliogenesi3 e nella spermiogenesi4. All’interno delle cellule di mammifero, le settine possono anche interagire con actina e microtubuli 5,6,7 in un legante di Rho GTPasi (BORG)-dipendentemodo 8. In vari tessuti (neuroni9, ciglia3, spermatozoi10), le settine sono state identificate come regolatori delle barriere di diffusione per componenti legati alla membrana11. Le settine hanno anche dimostrato di regolare il blebbing della membrana e la formazione di protrusioni12. Le septine, essendo proteine multi-tasking, sono implicate nell’emergere di varie malattie prevalenti13. La loro errata regolazione è associata all’emergere di tumori14 e malattie neurodegenerative15.
A seconda dell’organismo, diverse subunità della settina (due in Caenorhabditis elegans a 13 nell’uomo) si assemblano per formare complessi la cui organizzazione varia in modo tessuto-dipendente16. Il blocco di base della settina raccoglie da due a quattro subunità, presenti in due copie e auto-assemblati in modo palindromico simile a un’asta. Nel lievito in erba, le settine sono ottameriche17,18. In situ, le settine sono spesso localizzate in siti con curvatura micrometrica; Si trovano nei siti di costrizione della divisione, alla base delle ciglia e dei dendriti e nell’anello degli spermatozoi19,20. Alla membrana, il ruolo delle settine sembra essere duplice: sono implicate nel rimodellamento del doppio strato lipidico e nel mantenimento dell’integrità della membrana21. Quindi, studiare le proprietà biofisiche delle proteine e/o delle subunità che formano filamenti di septina sulla membrana è cruciale per comprendere il loro ruolo. Per analizzare le proprietà specifiche delle settine in un ambiente ben controllato, sono appropriati approcci in vitro bottom-up. Finora, solo pochi gruppi hanno descritto le proprietà biofisiche delle settine in vitro20,22,23. Quindi, rispetto ad altri filamenti citoscheletrici, le attuali conoscenze sul comportamento delle settine in vitro rimangono limitate.
Questo protocollo descrive come l’organizzazione dei filamenti di settina, il rimodellamento della membrana e la sensibilità alla curvatura possono essere analizzati19. A tal fine, è stata utilizzata una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica (microscopia a fluorescenza, microscopia crioelettronica [cryo-EM] e microscopia elettronica a scansione [SEM]). Il rimodellamento della membrana delle vescicole unilamellari giganti (GUV) di dimensioni micrometriche viene visualizzato utilizzando la microscopia ottica a fluorescenza. L’analisi della disposizione e dell’ultrastruttura dei filamenti di settina legati alle vescicole lipidiche viene eseguita utilizzando la crio-EM. L’analisi della sensibilità alla curvatura della settina viene effettuata utilizzando SEM, studiando il comportamento dei filamenti di settina legati a doppi strati lipidici solidi, depositati su substrati ondulati di curvature variabili, che consente l’analisi della sensibilità alla curvatura sia per curvature positive che negative. Rispetto alla precedente analisi20,24, qui proponiamo di utilizzare una combinazione di metodi per analizzare a fondo come le settine possono auto-assemblarsi, deformare sinergicamente la membrana ed essere sensibili alla curvatura. Si ritiene che questo protocollo sia utile e adattabile a qualsiasi proteina filamentosa che mostri un’affinità per le membrane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come detto sopra, è stata utilizzata una miscela lipidica che migliora l’incorporazione di PI(4,5)P2 all’interno del doppio strato lipidico e quindi facilita le interazioni settina-membrana. In effetti, abbiamo dimostrato altrove25 che le settine di lievito in erba interagiscono con le vescicole in modo PI(4,5)P2-specifico. Questa composizione lipidica è stata regolata empiricamente dallo screening di composizioni multiple ed è ora ampiamente utilizzata dagli autori. I lip…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Patricia Bassereau e Daniel Lévy per i loro utili consigli e discussioni. Questo lavoro ha beneficiato del sostegno dell’ANR (Agence Nationale de la Recherche) per il finanziamento del progetto “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e del progetto “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin è finanziato dall’Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” e dalla Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa è stato sostenuto dalla Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink è stato sostenuto dalla Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) attraverso il “BaSyC-Building a Synthetic Cell”. Sovvenzione per gravitazione (024.003.019). Si ringraziano Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) e Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Ringraziamo il Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, membro dell’Infrastruttura Nazionale di Ricerca France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
Referências
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