Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.
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Artigo de método
Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fim de decifrar os complexos mecanismos moleculares que regulam a montagem e desmontagem de filamentos actin, é um grande trunfo monitorar reações individuais que vivem em condições bem controladas. Para isso, experimentos de filamento único ao vivo surgiram nos últimos 20 anos, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF) e forneceram uma série de resultados-chave. Em 2011, a fim de ampliar ainda mais as possibilidades desses experimentos e evitar artefatos problemáticos recorrentes, introduzimos microfluidos simples nesses ensaios. Este estudo detalha nosso protocolo básico, onde filamentos de actina individuais são ancorados por uma extremidade à superfície passivated de deslizamento de cobertura, alinhados com o fluxo, e podem ser sucessivamente expostos a diferentes soluções proteicas. Também apresentamos os protocolos para aplicações específicas e explicamos como forças mecânicas controladas podem ser aplicadas, graças ao arrasto viscoso da solução de fluxo. Destacamos as ressalvas técnicas desses experimentos e apresentamos brevemente possíveis desenvolvimentos com base nessa técnica. Esses protocolos e explicações, juntamente com a disponibilidade atual de equipamentos de microfluidos fáceis de usar, devem permitir que não especialistas implementem este ensaio em seus laboratórios.
Introdução
A montagem e desmontagem de filamentos de actin e redes de filamentos de actin são controladas por diversas reações bioquímicas e dependem do contexto mecânico. Para obter uma visão desses mecanismos complexos, é inestimável ser capaz de observar reações individuais em filamentos individuais (em números suficientemente grandes). Ao longo das últimas décadas, a observação de filamentos dinâmicos de actina em tempo real, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF), emergiu como uma técnica-chave e forneceu uma lista impressionante de resultados que não poderiam ter sido obtidos com ensaios bioquímicos de solução em massa1
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Protocolo
1. Preparação da câmara microfluídica
- Selecione um molde mestre SU-8 com vários padrões de câmara. As câmaras típicas são em forma de cruz com três entradas e uma tomada, 20 μm de altura e 800 μm de largura (Figura 1). Tais moldes mestres podem ser adquiridos de empresas externas ou feitos em laboratórios acadêmicos (por exemplo, Gicquel, Y. et al.5).
- Coloque fita adesiva ao redor da borda do molde.
- Coloque ~50 cm de comprimento, 19 mm de largura, fita de escritório transparente padrão (ver Tabela de Materiais) em um banco, lado pegajoso para cima. Coloq....
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Resultados
Para todos os experimentos descritos acima, filamentos de actina fluorescentemente rotulados devem ser claramente visíveis, com bom contraste, indicativo de baixa fluorescência de fundo da superfície (Figura 4, ver Arquivo Suplementar 1 para solução de problemas comuns). Os filamentos actinados também não devem ficar na superfície: quando a taxa de fluxo dominante é baixa, as flutuações laterais dos filamentos actina devem ser perceptíveis ao observá-las ao vivo e permitir q.......
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Discussão
Comparado aos métodos padrão de filamento único, onde filamentos de actina são ancorados na superfície por vários pontos ao longo de seu comprimento ou mantidos perto dele por um agente de aglomeração como metilcelulose, os microfluidos oferecem uma série de vantagens. Como as interações com a superfície são mínimas, as pausas artificiais que essas interações podem induzir durante o alongamento e a despomerização são evitadas. Os filamentos são alinhados pelo fluxo, paralelos uns aos outros, facilitando seu monitoramento.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Somos gratos ao B. Ladoux e R.-M. Laboratório Mège para o uso de seus equipamentos de limpeza UV, e J. Heuvingh e 0. du Roure para o treinamento inicial que recebemos na preparação de moldes em wafers de silício e fornecendo dicas sobre microfluidos. Reconhecemos o financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa Grant StG-679116 (para A.J.) e Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (para G.R.-L.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| β-Caseína | Merck | C6905 | Usado a 8 mg/mL |
| Punção de biópsia (com êmbolo) | Ted Pella | 15115-2 | ID 0,75 mm, OD 1,07 mm |
| Biotina-BSA | Merck | A8549 | Usado a 1 mg/mL |
| BSA | Merck | A8022 | Usado a 50 mg/mL |
| Coverslip Mini-Rack Suporte de teflon | Invitrogen | C14784 | para 8 lamínulas |
| Lamínulas 22x40mm Espessura #1.5 | Menzel Glä ser | 631-1370 | |
| DABCO | Merck | D27802 | componente em f-buffer |
| DTT | Euromedex | EU0006-D | componente em f-buffer |
| Éster NHS Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | Fluoróforo para marcação de actina em Lys328. |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina | Thermo Scientific | 21338 | Para biotinilato de actina em Lys328 |
| Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | Detergente para limpeza de vidros |
| ImageJ | NIH | N / A | software de código aberto |
| Laboport | KNF | 811kn.18 | bomba de vácuo (vácuo final: 240 mbar) |
| Fita mágica invisível | Scotch | 7100024666 | fita de escritório transparente padrão |
| Micrewtube | Simport | T341-6T | 2 mL tubos de reservatório microfluídico |
| Dispositivo microfluídico Parte 1: Unidade de fluxo S | Fluigente FLUIGENT | FLU-S-D-PCKB | Medidor de vazão |
| Dispositivo microfluídico Parte 2: Fluiwell-4C-2 mL | Fluigent | 14002001PCK | Suporte de reservatório |
| Dispositivo microfluídico Parte 3: MFCS-EZ | Fluigent | EZ-11000001 EZ-00345001 Controlador de | pressão |
| modelo 42 - UVO-Cleaner | Jelight Inc. | 42-220 | Limpador ultravioleta |
| N6-(6-Aminohexil)-ATP-ATTO-488 | Jena Bioscience | NU-805-488 | ATP-ATTO usado para rotular a actina |
| neutravidina | Thermo Scientific | 31000 | |
| PLL-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | Use a 1 mg/mL em PBS. |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Elastômero de Silício | Dow Corning | 1673921 | Contém base PDMS e agente de cura |
| Tubulação de polieteretercetona (PEEK) | Merck | Z226661 | " Azul" : I.D. = 0,25 mm |
| Pistola de sopro de segurança | Coilhose Pneumatics | 700-S | ar filtrado |
| Tubo de silício | VWR | 228-0701P | conecta PEEK ao acoplador |
| Acoplador de cateter em aço inoxidável | Prime Bioscience | SC22/15 | Inserido nas entradas e saídas do PDMS para conectar ao tubo PEEK |
| Filme termoplástico | Sigma Aldrich | PM996 | "parafilme" padrão |
| Etanol ultrapuro | VWR | 64-17-5 | |
| Banho de limpeza ultrassónico | VWR | USC200TH | Para acomodar copos de 1 L |
| Exsicador a vácuo | SP Bel-Art | F42022-0000 | para desgaseificar o PDMS ou soluções |
Referências
- Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
- Kuhn, J. R., Pollard, T. D.
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Reimpressões e permissões
