Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique
Summary
Les études de la biomécanique de la paroi cellulaire sont essentielles pour comprendre la croissance et la morphogenèse des plantes. Le protocole suivant est proposé pour étudier les parois cellulaires primaires minces dans les tissus internes des jeunes organes végétaux à l’aide de la microscopie à force atomique.
Abstract
Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales et, par conséquent, la taille et la forme futures de la plante. De nombreuses techniques sophistiquées ont été développées pour mesurer ces propriétés; Cependant, la microscopie à force atomique (AFM) reste la plus pratique pour étudier l’élasticité de la paroi cellulaire au niveau cellulaire. L’une des limites les plus importantes de cette technique a été que seules les cellules vivantes superficielles ou isolées peuvent être étudiées. Ici, l’utilisation de la microscopie à force atomique pour étudier les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires appartenant aux tissus internes d’un corps végétal est présentée. Ce protocole décrit les mesures du module apparent de Young des parois cellulaires dans les racines, mais la méthode peut également être appliquée à d’autres organes végétaux. Les mesures sont effectuées sur des coupes de matériel végétal dérivées de vibratomes dans une cellule liquide, ce qui permet (i) d’éviter l’utilisation de solutions plasmolysantes ou d’imprégnation d’échantillons avec de la cire ou de la résine, (ii) de rendre les expériences rapides et (iii) de prévenir la déshydratation de l’échantillon. Les parois cellulaires anticlinales et périclinales peuvent être étudiées, selon la façon dont le spécimen a été sectionné. Les différences dans les propriétés mécaniques des différents tissus peuvent être étudiées dans une seule section. Le protocole décrit les principes de planification de l’étude, les problèmes liés à la préparation et aux mesures des éprouvettes, ainsi que la méthode de sélection des courbes force-déformation pour éviter l’influence de la topographie sur les valeurs obtenues du module d’élasticité. La méthode n’est pas limitée par la taille de l’échantillon, mais est sensible à la taille des cellules (c.-à-d. que les cellules avec une grande lumière sont difficiles à examiner).
Introduction
Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire végétale déterminent la forme de la cellule et sa capacité à se développer. Par exemple, l’extrémité en croissance du tube pollinique est plus molle que les parties non en croissance du même tube1. La formation de primordia sur le méristème d’Arabidopsis est précédée d’une diminution locale de la rigidité de la paroi cellulaire sur le site du futur primordium 2,3. Les parois cellulaires d’Arabidopsis hypocotyle, qui sont parallèles à l’axe de croissance principal et se développent plus rapidement, sont plus molles que celles qui sont perpendiculaires à cet axe et se développent plus lentement 4,5. Dans la racine de maïs, la transition des cellules de la division à l’élongation s’est accompagnée d’une diminution des modules élastiques dans tous les tissus de la racine. Les modules sont restés faibles dans la zone d’allongement et ont augmenté dans la zone d’allongement tardif6.
Malgré la disponibilité de diverses méthodes, les grands réseaux d’informations biochimiques et génétiques sur la biologie de la paroi cellulaire obtenus chaque année sont rarement comparés aux propriétés mécaniques des parois cellulaires. Par exemple, les mutants sur les gènes liés à la paroi cellulaire ont souvent une croissance et un développement altérés 4,7,8, mais sont rarement décrits en termes de biomécanique. L’une des raisons en est la difficulté d’effectuer des mesures aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La microscopie à force atomique (AFM) est actuellement la principale approche pour de telles analyses9.
Au cours des dernières années, de nombreuses études basées sur l’AFM sur la biomécanique de la paroi cellulaire végétale ont été réalisées. Les propriétés mécaniques des parois cellulaires des tissus externes d’Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 et de l’oignon 12, ainsi que des cellules cultivées13,14,15, ont été étudiées. Cependant, les cellules superficielles d’une plante peuvent avoir des parois cellulaires dont les propriétés mécaniques diffèrent de celles des tissus internes6. De plus, les cellules végétales sont pressurisées par la turgescence, ce qui les rend plus rigides. Pour se débarrasser de l’influence de la pression de turgescence, les chercheurs doivent utiliser des solutions plasmolysantes 2,3,4,5,10,11 ou décomposer les valeurs obtenues en apports de turgescence et de paroi cellulaire 12. La première approche conduit à la déshydratation de l’échantillon et modifie l’épaisseur et les propriétés de la paroi cellulaire16, tandis que la seconde approche nécessite des mesures supplémentaires et des mathématiques compliquées, et ne s’applique qu’aux cellules de forme relativement simple12. Les propriétés de la paroi cellulaire des tissus internes peuvent être évaluées sur des cryosections17 ou des sections de matériel végétal imprégnées de résine8. Cependant, les deux méthodes impliquent la déshydratation et / ou l’imprégnation des échantillons, ce qui entraîne inévitablement des changements dans les propriétés. Les propriétés des cellules isolées ou cultivées sont difficiles à relier à la physiologie de la plante entière. La culture et l’isolement des cellules végétales peuvent affecter les propriétés mécaniques de leurs parois cellulaires.
La méthode présentée ici complète les approches susmentionnées. En l’utilisant, les parois cellulaires primaires de n’importe quel tissu et à n’importe quel stade du développement de la plante peuvent être examinées. Les observations de sectionnement et d’AFM ont été effectuées dans un liquide, ce qui évite la déshydratation de l’échantillon. Le problème de la turgescence a été résolu au fur et à mesure que les cellules sont coupées. Le protocole décrit le travail avec les racines de maïs et de seigle, mais tout autre échantillon peut être examiné s’il convient à la section des vibratomes.
Les études AFM décrites ici ont été réalisées à l’aide de la technique force-volume. Différents instruments utilisent des noms différents pour cette méthode. Cependant, le principe de base est le même; Une carte force-volume de l’échantillon est obtenue par un mouvement sinusoïdal ou triangulaire du porte-à-faux (ou échantillon) pour atteindre une certaine force de charge à chaque point analysé, tout en enregistrant la déviation en porte-à-faux18. Le résultat combine une image topographique de la surface et le tableau des courbes force-distance. Chaque courbe est utilisée pour calculer la déformation, la rigidité, le module de Young, l’adhérence et la dissipation d’énergie en un point spécifique. Des données similaires peuvent être obtenues par spectroscopie de force point par point après balayage en modecontact 19, bien que cela prenne plus de temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales, et donc la taille et la forme futures de la plante. La méthode basée sur l’AFM présentée ici complète les techniques existantes qui sont utilisées pour étudier les propriétés des parois cellulaires végétales. Il permet d’étudier l’élasticité des parois cellulaires, qui appartiennent aux tissus internes de la plante. En utilisant la méthode présentée, les propri?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Dmitry Suslov (Université d’État de Saint-Pétersbourg, Saint-Pétersbourg, Russie) et le professeur Mira Ponomareva (Institut tatar de recherche scientifique sur l’agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russie) pour avoir fourni des semences de maïs et de seigle, respectivement. La méthode présentée a été développée dans le cadre du projet de la Fondation scientifique russe n ° 18-14-00168 attribué à LK. La partie du travail (obtention des résultats présentés) a été réalisée par AP avec le soutien financier de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
Referências
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