אפיון תכונות מכניות של דופן התא הראשוני באיברים חיים בצמחים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי
Summary
מחקרים על ביומכניקה של דופן התא חיוניים להבנת גדילת צמחים ומורפוגנזה. הפרוטוקול הבא מוצע לחקור דפנות תאים ראשוניות דקות ברקמות הפנימיות של איברים צמחיים צעירים באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי.
Abstract
התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. טכניקות מתוחכמות רבות פותחו למדידת תכונות אלה; עם זאת, מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) נותרה הנוחה ביותר לחקר גמישות דופן התא ברמה התאית. אחת המגבלות החשובות ביותר של טכניקה זו הייתה שניתן לחקור רק תאים חיים שטחיים או מבודדים. כאן מוצג השימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי כדי לחקור את התכונות המכניות של דפנות התאים הראשוניות השייכות לרקמות הפנימיות של גוף הצמח. פרוטוקול זה מתאר מדידות של מודולוס דפנות התאים של יאנג לכאורה בשורשים, אך ניתן ליישם את השיטה גם על איברים צמחיים אחרים. המדידות מבוצעות על מקטעים שמקורם ברטט של חומר צמחי בתא נוזלי, מה שמאפשר (1) להימנע משימוש בתמיסות פלסמוליזה או הספגת דגימה בשעווה או בשרף, (2) להפוך את הניסויים למהירים, ו-(3) למנוע התייבשות של הדגימה. ניתן לחקור הן את דפנות התאים האנטי-קלינליים והן את דפנות התאים הפריקלינליים, בהתאם לאופן שבו נותחה הדגימה. הבדלים בתכונות המכניות של רקמות שונות ניתן לחקור בסעיף אחד. הפרוטוקול מתאר את עקרונות תכנון המחקר, בעיות בהכנת דגימות ומדידות, וכן את השיטה לבחירת עקומות דפורמציה של כוח כדי למנוע את השפעת הטופוגרפיה על הערכים המתקבלים של מודולוס אלסטי. השיטה אינה מוגבלת על ידי גודל המדגם אלא רגישה לגודל התא (כלומר, תאים עם לומן גדול קשים לבדיקה).
Introduction
התכונות המכניות של דופן התא הצמחי קובעות את צורת התא ואת יכולתו לגדול. לדוגמה, הקצה הגדל של צינור האבקה רך יותר מהחלקים שאינם גדלים של אותו צינור1. להיווצרות הפרימורדיה ב-Arabidopsis meristem קדמה ירידה מקומית בנוקשות דופן התא באתר של הפרימורדיום 2,3 העתידי. דפנות התאים של ערבידופסיס היפוקוטיל, המקבילות לציר הצמיחה העיקרי וצומחות מהר יותר, רכות יותר מאלו הניצבות לציר זה וצומחות לאט יותר 4,5. בשורש התירס, מעבר התאים מחלוקה להתארכות לווה בירידה במודולי האלסטי בכל רקמות השורש. המודולי נשאר נמוך באזור ההתארכות ועלה באזור ההתארכות המאוחרת6.
למרות הזמינות של שיטות שונות, המערכים הגדולים של מידע ביוכימי וגנטי על ביולוגיה של דופן התא המתקבלים מדי שנה מושווים לעתים רחוקות עם התכונות המכניות של קירות התא. לדוגמה, מוטציות בגנים הקשורים לדופן התא שינו לעתים קרובות את הגדילה וההתפתחות 4,7,8, אך הן מתוארות רק לעתים רחוקות במונחים של ביומכניקה. אחת הסיבות לכך היא הקושי לבצע מדידות ברמה התאית והתת-תאית. מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) היא כיום הגישה העיקרית לניתוחים כאלה9.
בשנים האחרונות בוצעו מחקרים רבים מבוססי AFM על ביומכניקה של דופן התא הצמחי. התכונות המכניות של דפנות התאים של הרקמות החיצוניות של Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 ובצל 12, כמו גם של תאים בתרבית13,14,15, נחקרו. עם זאת, לתאים השטחיים של צמח עשויים להיות דפנות תאים שתכונותיהם המכניות שונות מאלו של הרקמות הפנימיות6. בנוסף, תאי הצמח מופעלים בלחץ על ידי טורגור, מה שהופך אותם לנוקשים יותר. כדי להיפטר מהשפעת לחץ הטורגור, החוקרים צריכים להשתמש בתמיסות פלסמוליזינג 2,3,4,5,10,11 או לפרק את הערכים המתקבלים לתרומות טורגור ודופן התא 12. הגישה הראשונה מובילה להתייבשות דגימה ומשנה את עובי ותכונות דופן התא16, ואילו הגישה השנייה דורשת מדידות נוספות ומתמטיקה מורכבת, וחלה רק על תאים בעלי צורה פשוטה יחסית12. ניתן להעריך את תכונות דופן התא של רקמות פנימיות על cryosections17 או חלקים של חומר צמחי ספוג שרף8. עם זאת, שתי השיטות כרוכות בהתייבשות ו/או הספגה של דגימות, מה שמוביל בהכרח לשינויים במאפיינים. קשה להתייחס לתכונות של תאים מבודדים או מתורבתים לפיזיולוגיה של הצמח כולו. גם טיפוח וגם בידוד של תאי צמחים יכולים להשפיע על התכונות המכניות של דפנות התאים שלהם.
השיטה המוצגת כאן משלימה את הגישות הנ”ל. באמצעותו ניתן לבחון את דפנות התאים הראשוניים של כל רקמה ובכל שלב של התפתחות הצמח. תצפיות חתך ו-AFM בוצעו בנוזל המונע התייבשות דגימה. בעיית הטורגור נפתרה כאשר התאים נחתכים. הפרוטוקול מתאר עבודה עם שורשי תירס ושיפון, אך ניתן לבחון כל דגימה אחרת אם היא מתאימה לחיתוך ויברטום.
מחקרי ה-AFM המתוארים כאן בוצעו בטכניקת כוח-נפח. מכשירים שונים משתמשים בשמות שונים לשיטה זו. עם זאת, העיקרון הבסיסי זהה; מפת נפח כוח של הדגימה מתקבלת על ידי תנועה סינוסואידלית או משולשת של הקנטילבר (או הדגימה) כדי להשיג כוח טעינה מסוים בכל נקודה מנותחת, תוך רישום סטיית הקנטילבר18. התוצאה משלבת תמונה טופוגרפית של פני השטח ומערך עקומות מרחק הכוח. כל עקומה משמשת לחישוב העיוות, הנוקשות, המודולוס, ההידבקות ופיזור האנרגיה של יאנג בנקודה מסוימת. נתונים דומים ניתן לקבל על ידי ספקטרוסקופיית כוח נקודה אחר נקודה לאחר סריקה במצב מגע19, אם כי זה יותר זמן רב.
Protocol
Representative Results
Discussion
התכונות המכניות של דפנות התא הראשוניות קובעות את הכיוון והקצב של צמיחת תאי הצמח, ולכן את גודלו וצורתו העתידיים של הצמח. השיטה מבוססת ה-AFM המוצגת כאן משלימה את הטכניקות הקיימות המשמשות לחקר התכונות של דפנות תאי צמחים. הוא מאפשר לחקור את גמישות דפנות התא, השייכות לרקמות הפנימיות של הצמח. בשיט…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר דמיטרי סוסלוב (אוניברסיטת סנקט פטרבורג, סנקט פטרבורג, רוסיה) ופרופ’ מירה פונומארבה (מכון המחקר המדעי הטטרי לחקלאות, FRC KazSC RAS, קאזאן, רוסיה) על אספקת זרעי תירס ושיפון, בהתאמה. השיטה המוצגת פותחה במסגרת פרויקט קרן המדע הרוסית מס ’18-14-00168 שהוענק ל- LK. החלק של העבודה (קבלת התוצאות שהוצגו) בוצע על ידי AP עם תמיכה כספית של המשימה הממשלתית עבור המרכז המדעי FRC קאזאן של RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
Referências
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Biologia do Desenvolvimento. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
