Utilizando a fatia pulmonar cortada com precisão para estudar a regulação contratil das vias aéreas e do músculo liso arterial intrapulmonar

Summary

O presente protocolo descreve a preparação e utilização de fatias pulmonares cortadas com precisão do rato para avaliar as vias aéreas e a contratilidade muscular liso arterial intrapulmonar em um ambiente quase in vivo .

Abstract

As células musculares lisas (SMC) mediam a contração das vias aéreas e da artéria intrapulmonar para modificar a resistência ao fluxo de ar e a circulação pulmonar, respectivamente, desempenhando um papel crítico na homeostase do sistema pulmonar. A desregulamentação da contralução da SMC contribui para várias doenças pulmonares, incluindo asma e hipertensão pulmonar. No entanto, devido ao acesso limitado aos tecidos e à falta de sistemas culturais para manter os fenótipos in vivo SMC, os mecanismos moleculares subjacentes à contratlidade SMC desregulamentada nessas doenças permanecem totalmente identificados. A fatia pulmonar de corte de precisão (PCLS) oferece um modelo ex vivo que contorna essas dificuldades técnicas. Como uma seção de tecido pulmonar vivo e fino, o PCLS retém O SMC em ambientes naturais e permite o rastreamento in situ da contração do SMC e sinalização intracelular ca²⁺ que regula a contração do SMC. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação pcls detalhado do mouse, que preserva vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares. Este protocolo envolve dois passos essenciais antes de submeter o lobo pulmonar ao corte: inflar as vias aéreas com ponto de fusão baixo agarose através da traqueia e enchimento de vasos pulmonares com gelatina através do ventrículo direito. O PCLS preparado usando este protocolo pode ser usado para bioensaio para avaliar a regulação contraítária de CA²⁺mediada da SMC tanto nas vias aéreas quanto nos compartimentos arteriais intrapulmonares. Quando aplicado a modelos de camundongos de doenças respiratórias, este protocolo permite a investigação funcional do SMC, fornecendo assim uma visão do mecanismo subjacente da desregulamentação da contração da SMC em doenças.

Introduction

A célula muscular lisa (SMC) é um tipo de célula estrutural importante no pulmão, residindo principalmente na parede de mídia das vias aéreas e vasos pulmonares. As SMCs contraem para alterar o calibre luminal, regulando assim o fluxo de ar e sangue ^1,2. Portanto, a regulação conjuntura de SMCs é essencial para manter a homeostase da ventilação de ar e circulação pulmonar. Em contraste, a contratilidade aberrante do SMC provoca vias aéreas obstrutivas ou doenças vasculares pulmonares como asma e hipertensão arterial pulmonar. No entanto, a avaliação funcional das SMCs pulmonares tem sido desafiada pelo acesso limitado ao tecido pulmonar, especialmente aquelas pequenas vias aéreas e microvexes na parte distal do pulmão ^2,3. As soluções atuais recorrem a ensaios indiretos, como medir a resistência ao fluxo de ar pela Flexivent para refletir a constrição das vias aéreas e verificar a pressão arterial pulmonar pelo cateterismo cardíaco direito para avaliar a vasocontração pulmonar ^4,5. No entanto, esses ensaios indiretos têm múltiplas desvantagens, como ser confundido por fatores estruturais, não captar a diversidade espacial das vias aéreas ou respostas vasculares em toda a escala pulmonar ^6,7, e a inaptidão para o estudo mecanicista da regulação contratil no nível celular. Portanto, abordagens alternativas utilizando células primárias isoladas, tiras musculares de traqueia/brônquico ^8,9, ou grandes segmentos vasculares¹⁰ foram aplicadas para o estudo SMC in vitro. No entanto, esses métodos também têm limitações. Por exemplo, uma rápida adaptação fenotípica dos SMCs primários na condição^{de cultura 11,12} torna problemático extrapolar achados da cultura celular para configurações in vivo. Além disso, o fenótipo contracttil de SMCs nas vias aéreas proximais isoladas ou segmentos vasculares pode não representar as SMCs no pulmão distal ^6,7. Além disso, a medição da força muscular no nível do tecido permanece dissociada de eventos moleculares e celulares que são essenciais para uma visão mecanicista sobre a regulação contratil.

A fatia pulmonar cortada com precisão (PCLS), uma seção de tecido pulmonar vivo, fornece uma ferramenta ex vivo ideal para caracterizar SMCs pulmonares em um microambiente quase in vivo (ou seja, arquitetura multicelular preservada e interação)¹³. Desde que os Drs. Placke e Fisher introduziram pela primeira vez a preparação de fatias pulmonares de pulmões de ratos e hamsters inflados pela agarose nos^{anos 14,15}, essa técnica tem avançado continuamente para fornecer aos PCLSs maior qualidade e maior versatilidade para pesquisas biomédicas. Uma melhora significativa é o aprimoramento da preservação arterial pulmonar por infusão de gelatina, além da inflação pulmonar com agarose através da traqueia. Como resultado, tanto as vias aéreas quanto as artérias pulmonares são mantidas intactas no PCLS para avaliação ex vivo ¹⁶. Além disso, o PCLS é viável por um tempo prolongado na cultura. Por exemplo, os PCLSs do mouse não tiveram nenhuma mudança significativa na viabilidade celular e metabolismo por um mínimo de 12 dias na cultura, bem como, eles mantiveram a contração das vias aéreas por até 7 dias¹⁷. Além disso, o PCLS mantém vias aéreas ou embarcações de tamanho diferente para ensaios de contração e relaxamento. Além disso, a sinalização intracelular Ca²⁺ de SMCs, fator determinante da contratilação celular, pode ser avaliada com corantes de repórter Ca²⁺ retratados por um microscópio confocal ou de 2 fótons¹³.

Considerando a ampla aplicação do modelo de camundongos em pesquisa pulmonar, um protocolo detalhado é descrito aqui para a preparação do PCLS do rato com vias aéreas intactas e artérias intrapulmonares para pesquisa pulmonar ex vivo . Utilizando os PCLSs preparados, demonstramos posteriormente como avaliar as vias aéreas e as respostas arteriais pulmonares a estímulos constritivos ou relaxantes. Além disso, também são descritos o método de carregamento do PCLS com corante de repórter Ca²⁺ e, em seguida, a sinalização ca²⁺ de SMCs associadas a respostas contratuais ou relaxantes.

Protocol

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts. Foram utilizados camundongos machos do tipo selvagem C57/B6, com 8 semanas de idade, para o presente estudo. 1. Preparação experimental Prepare a solução de trabalho. Prepare a solução de sal balanceado 1x Hank ‘s Balanced (HBSS, com Ca2+ e Mg2+, e pH balanceado com HEPES de 20 …

Representative Results

Preparação do MOUSE PCLS preservando vias aéreas e artérias intrapulmonares intactasUm PCLS de 150 μm de espessura foi observado sob o microscópio de contraste de fase invertido. Nos pulmões do rato, as vias aéreas condutoras são acompanhadas por artérias intrapulmonares, indo do hilus ao pulmão periférico. Um pacote representativo de artérias aéreas pulmonares em um PCLS de rato é mostrado na Figura 2B. As vias aéreas podem ser facilmente identificadas p…

Discussion

A preparação do PCLS envolve várias etapas críticas. Em primeiro lugar, é essencial inflar o lobo pulmonar de forma homogênea para evitar a variação da rigidez tecidual da distribuição desigual da ágarose. Como o líquido agarose rapidamente géis em cateteres finos ou vias aéreas a uma temperatura abaixo de 37 °C, o defeito de enchimento resultante no campo pulmonar distal poderia aumentar a disparidade de rigidez do tecido pulmonar e causar ruptura de tecido durante a seção vibratome. Portanto, manter a …

Materials

1 mL syringe	BD	309626
15 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229411
3 mL syringe	BD	309585
50 mL sterile centrifuge tubes	Celltreat	229422
Acetyl-beta-methacholine	Millipore Sigma	62-51-1
Antibiotic-anitmycotic	Thermo Fisher	15240-062
CCD-camera	Nikon	Nikon Ds-Ri2 camera
Cover glassess	Fisher Scientific	12-548-5CP; 12-548-5PP
Cryogenic vials	Fisher Scientific	430488
Custom-built laser scanning confocal microscope			Details in Reference 18
DMEM/F12	Fisher Scientific	MT-10-092-CM
Endothelin 1	Millipore Sigma	E7764
Fine dissecting scissor	Fisher Scientific	NC9702861
Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	9000-70-8
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher	14025092
Hemostatic forcep	Fisher Scientific	16-100-117
HEPES	Thermo Fisher	15630080
High vaccum silicone grease	Fisher Scientific	146355d
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907-1KG-K
Metal washers	Home Depot Product Authority	800442	Everbilt Flat Washers #10
Micro-dissecting forcep	Sigma-Aldrich	F4142
Needle scalp vein set (25 G)	EXELINT	26708
NOC-5	Cayman Chemical	16534
Nylon mesh	Component Supply	U-CMN-300
Oregon green 488 BAPTA-1 AM	Life Technologies	o-6807
Phase-contrast microscope	Nikon	Nikon Eclipse TS 100
Pluronic F-127	Thermo Fisher	P-6867
Razor blades	Personna		Personna Double Edge Razor Blades in White Wrapper 100 count
Sulfobromophthalein	Sigma-Aldrich	S0252
Superglue	Krazy Glue		Krazy Glue, All purpose
Ultrapure low melting point agarose	Thermo Fisher	16520050
Vibratome	Precisionary	VF 310-0Z
Vibratome chilling block	Precisionary	SKU-VM-CB12.5-NC
Vibratome specimen tube	Precisionary	SKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y shaped IV catheter	BD	383336	BD Saf-T-Intima closed IV catheter