Utvikling av Drosophila melanogaster-modeller for avbildning og optogenetisk kontroll av hjertefunksjon

Summary

Denne protokollen beskriver genereringen av Drosophila melanogaster som uttrykker eNpHR2.0 eller ReaChR opsiner i hjertet for OCT-avbildning og optogenetisk hjertepacing. Detaljerte instruksjoner for Drosophila OCT-avbildning og hjerteslagsmodulering, inkludert simulering av gjenopprettelig hjertestans, bradykardi og takykardi hos levende dyr i forskjellige utviklingsstadier, er rapportert.

Abstract

Bruk av Drosophila melanogaster (fruktflue) som modellorganisme har sikret betydelig fremgang på mange områder av biologisk vitenskap, fra cellulær organisering og genomiske undersøkelser til atferdsstudier. På grunn av den akkumulerte vitenskapelige kunnskapen ble Drosophila de siste årene brakt til modellering av menneskelige sykdommer, inkludert hjertesykdommer. Det presenterte arbeidet beskriver det eksperimentelle systemet for overvåking og manipulering av hjertefunksjonen i sammenheng med en hel levende organisme ved hjelp av rødt lys (617 nm) og uten invasive prosedyrer. Kontroll over hjertet ble oppnådd ved hjelp av optogenetiske verktøy. Optogenetikk kombinerer uttrykket av lysfølsomme transgene opsiner og deres optiske aktivering for å regulere det biologiske vevet av interesse. I dette arbeidet ble et tilpasset integrert optisk koherenstomografi (OCT) bildebehandlings- og optogenetisk stimuleringssystem brukt til å visualisere og modulere det fungerende D. melanogaster-hjertet ved 3rd instar larve og tidlige puppeutviklingsstadier. UAS/GAL4 dobbeltgenetisk system ble brukt til å uttrykke halorhodopsin (eNpHR2.0) og rødforskjøvet kanalrhodopsin (ReaChR), spesielt i fluehjertet. Detaljer om forberedelse av D. melanogaster for live OCT-avbildning og optogenetisk pacing er gitt. En laboratorieutviklet integrasjonsprogramvare behandlet bildedataene for å lage visuelle presentasjoner og kvantitative egenskaper ved Drosophila hjertefunksjon. Resultatene viser muligheten for å initiere hjertestans og bradykardi forårsaket av eNpHR2.0-aktivering og utføre hjertepacing ved ReaChR-aktivering.

Introduction

Ved utgangen av 2010 valgte tidsskriftet Nature Methods optogenetikk som årets metode¹. Ved hjelp av genetiske verktøy (transgene opsiner) regulert av lys for å kontrollere biologisk vev av interesse med enestående presisjon og hastighet åpnet en flomport for nye applikasjoner. Til dags dato tilhører flertallet av prestasjonene nevrovitenskap. Teknologien ble introdusert som en ny metode for presis kontroll av enkeltneuroner² og har avansert til funn innen levende organisme kognitive funksjoner³. Fra starten demonstrerte nevrologer evnen til å modulere hele organismenes oppførsel. Ekspresjon og lysaktivering av ChR2 opsin hos mus dopaminerge nevroner forårsaket deres aktivering og var tilstrekkelig til å drive atferdskondisjonering⁴. Optogenetisk inhibering av en undergruppe av nevroner som inneholder halorhodopsin NpHR2.0 levert til det epileptiske fokuset på gnagerhjernen resulterte i demping av elektroencefalografiske anfall⁵.

Optogenetiske anvendelser i kardiologi utvikler seg i jevnt tempo⁶. ChR2 ble vellykket uttrykt i kardiomyocytter cellekultur og hos mus; Hjertetempo ble utført av blinker av blått lys (utført ved hjelp av en implantert fiber i levende dyr)⁷. I sebrafisk ble ChR2 uttrykt og brukt til å identifisere den temposkapende hjerteregionen; NpHR-aktivering induserte hjertestans⁸. Optogenetisk hjertepacing har det unike potensialet for å utvikle nye pacing- og resynkroniseringsbehandlinger⁹. Forsøk på å etablere et autogent arytmiavslutningssystem er rapportert nylig også¹⁰.

Omfattende forskning og utvikling av nye terapeutiske behandlinger krever anvendelse av ulike modellsystemer, fra cellekultur til pattedyr. Et virveldyrs hjerte er et svært komplekst organ. Kardiomyocytter (CM) utgjør en tredjedel av alle hjerteceller; Andre celler inkluderer nevroner, vaskulære glatte muskelceller og ikke-spennende celler (dvs. endotelceller, fibroblaster og immunceller). Forskning på CM-cellekultur begrenser oversettelsen av de oppnådde resultatene til menneskelige medisinske applikasjoner. Pattedyrmodellorganismers genetiske manipulasjoner er begrensede og tidkrevende. Mindre virvelløse modeller har mange fordeler; Deres kardiovaskulære system bærer alle de essensielle histologiske elementene. Drosophila melanogaster (bananflue) er et enkelt og kraftig genetisk modellsystem for å undersøke rollen til gener assosiert med menneskelige sykdommer, inkludert hjertesykdommer^11,12,13. Som kortlivede dyr representerer bananfluer en utmerket mulighet til å modellere alders- eller sykdomsavhengige hjertefunksjonsendringer som kan spores gjennom livet^14,15,16,17. Fruktfluens hjerterør ligger på dorsalsiden av kroppen innen 200 μm fra neglebåndoverflaten, slik at synlig til nær-infrarødt lys når hjerterøret. Denne anatomiske funksjonen muliggjør ikke-invasiv optisk pacing av Drosophila-hjertet ved hjelp av eksisterende optogenetiske verktøy.

For å overvåke Drosophila-hjertet ble et tilpasset spektral-domene optisk koherenstomografi (SD-OCT) bildebehandlingssystem med en integrert LED-eksitasjonsmodul for rødt lys utviklet¹⁸. Morfologiske og rytmiske endringer i et relativt enkelt fruktfluehjerte kan lett analyseres med denne ikke-invasive biomedisinske bildebehandlingsteknologien 12,19,20,21. Med forbedret optisk seksjoneringsytelse og romlig oppløsning i mikronskala har OCT blitt brukt til å undersøke strukturen og overvåke funksjonen til Drosophila-hjertet i forskjellige utviklingsstadier, inkludert 3rd instar larve og tidlig puppe¹⁸. Dette systemet muliggjør også samtidig overvåking og stimulering av Drosophilas hjertetilstand i det intakte dyret. En skjematisk visning av OCT-systemet er vist i figur 1. SD-OCT-systemet bruker en superluminescerende diode (SLD) som lyskilde (senterbølgelengde: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, se materialtabell). Ved hjelp av en 10x objektivlinse kan OCT-bildesystemet oppnå en aksial oppløsning på ~ 4,4 μm i luft og ~ 3,3 μm i vev og en lateral oppløsning på ~ 2,8 μm, tilstrekkelig til å løse fine detaljer om fluehjertestrukturene^18,22. Interferenssignaler fra reflektert lys fra referansearmen og prøvearmen registreres ved hjelp av et spektrometer med et 2048-piksel linjeskanningskamera (maks linjehastighet: 80 kHz, se materialfortegnelse). Den målte systemfølsomheten er ~95,1 dB. Hver B-modus OCT-skanning genererer et tverrsnittsbilde i xz-bildeplanet. Gjentatte B-modusbilder er anskaffet på samme sted for å lage M-modusbilder som fanger det bankende hjertet i over ~ 30 s 18,22,23. Bildefrekvensen for M-modus-avbildning er ~ 125 bilder / s, tilstrekkelig til å fange fruktfluehjerteslagdynamikken.

For optogenetisk regulering av Drosophila hjertefunksjon, er en belysningsmodul med en 617 nm LED-lyskilde integrert med prøvearmen til SD-OCT-systemet. Stimuleringslyset er fokusert på en ~ 2,2 mm diameter flekk på prøveoverflaten, i samme posisjon som bildefokuspunktet. En spesialskrevet programvare brukes til å kontrollere belysningsmodus (lysintensitet, pulsbredde og driftssyklus), justere lyspulsstimuleringsfrekvensen og synkronisere LED-modulbelysningen og M-modus OCT-bildeopptak²².

Nylige publikasjoner beskrev Drosophila-transgensystemet som består av spatiotemporalt regulert ChR2, ReaChR og eNpHR2.0 opsiner ved bruk av UAS / GAL4 genetisk system. De oppnådde resultatene har vist evnen til å initiere hjertestans og bradykardi forårsaket av rødt lysaktivering av eNpHR2.0 og høyere frekvens hjertepacing forårsaket av blålysaktivering av ChR2. Lignende pacing eksperimenter ble utført med en annen channelrhodopsin, ReaChR, induserbar ved rødt lys^{belysning 22,23,24}. Opsinuttrykket i alle de beskrevne forsøkene ble drevet av 24B-GAL4, hvor opsinuttrykk ble observert i et bredt spekter av vev, inkludert kardiomyocytter og omkringliggende muskelceller. I den nåværende studien ble 24B-GAL4 erstattet av en Hand-GAL4-driver for å oppnå hjertespesifikt eNpHR2.0 og ReaChR opsins uttrykk.

Samlet sett viser de presenterte eksperimentelle resultatene gjenopprettelig hjertestans og induserbar bradykardi og takykardi hjertesykdommer. En detaljert protokoll med trinnvise instruksjoner om å lage transgene Drosophila-modeller og gjennomføre samtidig OCT-avbildning og optogenetiske pacing-eksperimenter hos levende dyr er gitt.

Protocol

For denne studien, eNpHR2.0 transgen linje w [*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, og hjertespesifikk GAL4-driver som inneholder håndgenreguleringsfragment w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (dette driverlageret vil bli angitt som Hand-GAL4) ble brukt. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 ble brukt som GFP-reporterlinje. De nevnte Drosophila-lagrene ble hentet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, se materialtabell) og opprettholdt ved romtemperatur eller ved 18 °C på standard maismelmedier. Drosophila-modellene utviklet i denne studien er tilgjengelige på forespørsel for samarbeid. 1. Drosophila genetiske kryss og medieforberedelse Endre den tredje kromosombalanseren TM3 Sb[1] til TM6 Sb Tb, og skape w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Se supplerende figur 1 for kryssingsordningen. Sett kryss i hetteglass med vanlige maismelmedier.MERK: Tilstedeværelsen av en Tb-markør gjør det mulig for brukere å skille larver og pupper som inneholder opsintransgen og GAL4-driveren fra dyr som inneholder opsin, men ingen driver25. Hold de genetiske kryssene i en 25 ° C, 70% fuktighetsinkubator på spesielt formulert all-trans retinaI (ATR) -holdige medier (se Materialtabell) i mørket i 5 dager for larversamling og 6 dager for puppesamling. Kombiner fem Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb jomfruhunner og to til tre hanner fra UAS-opsin-aksjer (eNpHR2.0 eller ReaChR) per hetteglass. Se kryssdiagrammet for eNpHR2.0 og ReaChR opsin i henholdsvis figur 2A og figur 2B. Neste dag, lag ATR-holdige medieflasker.Tilbered semi-definert mat i henhold til instruksjonene i BDSC26. I stedet for sukrose og glukose, tilsett bare sukrose (5,14 g / 100 ml). Avkjøl til ~60 °C under konstant omrøring. Forbered hetteglass med smale fluer, og tilsett 50 μL 100 mM ATR-etanoloppløsning til hvert hetteglass. Bruk en serologisk pipette til å kaste fluefôr til smale hetteglass, 5 ml per hetteglass. Vortex ved maksimal hastighet i 10 s. Koble hetteglassene, og pakk dem inn i det mørke stoffet for å beskytte dem mot lys. La hetteglassene tørke i minst 12 timer (over natten). Neste dag, overfør fluene jevnt og legg egg fra trinn 1.3. til hetteglassene med ATR-holdig mat (trinn 1.4.4.). Beskytt stativene med hetteglass mot lys. Etter 24-48 timer (avhengig av antall egg lagt), kast foreldrene for å forhindre hetteglass overpopulasjon. Samle ikke-Tb avkom og bruk dem til hjerteavbildning.MERK: De fenotypiske forskjellene i larve- og puppetrinnene er vist i figur 2C. Sammendraget og den omtrentlige tidslinjen for prøveprepareringstrinnene er vist i figur 3. 2. Optogenetisk kontroll av Drosophila hjertet Plukk UAS-opsin/Hand-GAL4 larve/puppe fra hetteglasset (trinn 1.7.), ta på vev, og tørk forsiktig av mediet fra kroppsoverflaten ved hjelp av en malebørste. Forbered mikroskopglasset og legg et lite stykke dobbeltsidig tape i midten. Bruk en børste eller fin pinsett til å plassere larven/puppen forsiktig på tapeoverflaten med ryggsiden opp og vinkelrett på langsiden av lysbildet. Trykk forsiktig for å feste larven/puppen til tapeoverflaten. Sett opp lysbildet på bildestadiet, larve/puppe vendt nedover. Slå på OCT-lyskilden med laserkontrollprogramvare (se materialfortegnelse). Åpne den spesialskrevne SD-OCT-kontrollprogramvaren, og klikk deretter på forhåndsvisningsvinduet . Still inn skanneparametrene i SD-OCT-programvaren.MERK: Målet er å justere prøven for optimal avbildning av det bankende hjertet, slik at valg av X-område og Y-område dekker hjertets region. På dette trinnet er både antall A-skanninger og B-skanninger 400. Området i x- og y-retningene er ~490 μm og ~537 μm, og viser hjertets to ortogonale tverrsnitt (henholdsvis xz og yz). Bruk mikromanipulatorer til å kontrollere prøvetrinnet for å bringe fluehjertet i fokus. Juster fokusposisjonen for å minimere lysrefleksjon fra fluens kutikulaoverflate. Vurder å bruke mineralolje på larven / puppens overflate for å minimere refleksjon.MERK: Olje kan øke risikoen for dyrs bevegelse ved å kompromittere båndlimets egenskaper. Sørg for at fluehjertet kan sees fullt ut i bildevinduet uten forvrengninger, blir blokkert av vev og ikke-ubetydelige skygger og refleksjoner; Ellers går du tilbake til trinn 2.7. Angi skanneparametrene for M-modus OCT-bildeinnhenting.MERK: Antall A-skanninger er redusert sammenlignet med trinn 2.7. for raskere bildefrekvens for å fange opp fluehjertets slagdynamikk (flere Hz). Antall B-skanninger angir antall gjentatte bilder for M-modus-avbildning, som kan justeres basert på opptakstid og tilgjengelig systemminne. I dette eksperimentet kan 128 A-skanninger tillate en hastighet på ~ 125 bilder / s, og 4000 gjentatte B-skanninger registreres, noe som gir et kontinuerlig opptak på ~ 32 s. Skaff fem sett med kontrolldata uten stimuleringspulser for rødt lys for å beregne hvilepulsen (RHR). Design lyspulsen for pacing-stimuleringen i den tilpassede OCT-kontrollprogramvaren. I “Innstillinger” legger du til de utformede lyspulssekvensene for å kontrollere pulsfrekvens, pulsbredde, stimuleringsvarighet og ventetid i henhold til forskjellige stimuleringsprotokoller.MERK: RHR måles fra kontrolleksperimentet uten lysbelysning og brukes til å beregne hvor ofte lyset skal pulseres for takypacing og bradypacing eksperimenter22. Åpne lysstyringsprogramvaren (se Materialfortegnelse) for å generere røde lyspulser. Velg pulsmodus i “Modusvalg”. Dobbeltklikk på figuren for “Pulse Profile” -innstillingene og velg Follower Mode. Hold AV-intensiteten som 0, og still inn PÅ-intensitetsprosenten ved beregning av den faktiske effekttettheten.MERK: Stimuleringslyspulser utløses av et signal fra OCT-kontrollprogramvaren i henhold til innstillingene i trinn 2.12. Skaff deg M-modusvideoer av det bankende Drosophila-hjertet med lysstimulering ved å klikke på Skaff deg i OCT-kontrollprogramvaren. Gjenta målingene 5x. 3. Bildeanalyse Åpne den spesialutviklede programvaren for segmentering av fluehjerte. Klikk på Velg fil og velg deretter filen som skal analyseres i GUI som vises. Skriv inn både de vertikale og horisontale grensene for hjerteområdet i piksler i de øverste tekstboksene. Klikk på Endre størrelse. Bruk glidebryteren på bunnen, og sørg for at hele hjerteområdet er synlig og at det fyller opp hele boksen for hele samlingen. Hvis det ikke er det, gjenta denne prosessen og juster grensene. Klikk på Forutsi for å forutsi hjerteregionen. Programmet vil nå gå gjennom hver skive i samlingen og velge hjerteregion, som tar ca. 3 min. Klikk på HR Plot når prediksjonen er fullført. Dette vil åpne et nytt vindu som viser et plott av hjerteområdet over tid. Sørg for at riktige topp- eller dalområder velges. Velg Pulse og deretter HR for å generere en endelig figur, og de funksjonelle parametrene lagres i de .csv filene samtidig.

Representative Results

D. melanogaster dyr som uttrykker røde lysfølsomme opsiner eNpHR2.0 eller ReaChR i hjerterøret ble generert ved å skaffe avkom fra krysset mellom hver UAS-opsin transgen linje og Hand-GAL4 driver. Vevsspesifisiteten til GAL4-driveren ble verifisert ved avbildning av GFP-ekspresjon (figur 4). Drosophila 3rd instar larve og tidlige puppe utviklingsstadier ble brukt til å demonstrere effekten av eNpHR2.0 og ReaChR aktivering ved rødt lys. Designet ~ 617 nm rødt lyspulser, levert av LED, opplyste larven / puppen og aktiverte eNpHR2.0 og ReaChR i hjertet. Selv om den rapporterte maksimale responsbølgelengden til NpHR er ~ 580 nm og ReaChR er ~ 600 nm, kan 617 nm lysbelysning trenge dypere med forbedret lysenergilevering mot opsinuttrykkende hjertevev22. Montert på mikroskopet lysbildet med dorsalsiden ned i det omvendte mikroskopoppsettet, ble larven / puppen opplyst av en LED-lysstråle rettet mot A7-kroppssegmentet. Eksempler på kroppstverrsnittsbilder er vist i figur 5A og figur 6A. Hjertet fremstår som en kontraherende og dilaterende sirkulær form i videoopptakene som består av 4000 bilder (Tilleggsvideoer 1-6). For å etterligne forskjellige hjertesykdommer ble fire typer lyspulser designet. En enkelt puls som varte i 10 s etter 5 s ventetid genererte gjenopprettelig hjertestans indusert av eNpHR2.0, som vist i figur 5B. For hjertetempoet ved frekvenser som er langsommere enn hvilepulsen (RHR), mediert av eNpHR2.0, ble det brukt to lyspulssekvenser med tempofrekvenser lik RHR/2 og RHR/4 som varer 8 s med en ventetid på 6 s i mellom (figur 5C). Driftssyklusen for hver lyspulssekvens var 90 %. Dette lysstimuleringsregimet forårsaket en hjertesykdom som minner om bradykardi. Stimuleringsmønsteret for å øke hjertefrekvensen på grunn av ReaChR-aktivering besto av tre sekvenser av lyspulser ved frekvenser på henholdsvis RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz, med en pulsbredde på 20 ms (figur 5D). Dette pulsregimet var rettet mot å forårsake en takykardisk hjertesykdom. Lystettheten var 7,49 mW/mm2 under alle forsøkene. For kontrolleksperimenter ble det ikke satt lysbelysning. Hver eksperimentell variant ble registrert fem ganger. M-modus videoer av fluehjertet ble behandlet til 2D-masker ved hjelp av FlyNet 2.027. Denne programvaren segmenterer automatisk hjerteregionen for å produsere datasettene for hjertefunksjonen. Programmet gir en maske av hjertet i hver ramme, som kan korrigeres ytterligere manuelt, om nødvendig, for å generere nøyaktig kvantifisering av de funksjonelle parametrene til det bankende hjertet, for eksempel hjertefrekvens (HR), end-diastolisk dimensjon (EDD) og end-systolisk dimensjon (ESD), fraksjonell forkortelse (FR), end-diastolisk område (EDA), end-systolisk område (ESA), etc. Hjertefrekvensen måles ved å analysere hjerteområdet over tid. Kontrollvideoen uten lyspulser brukes til å etablere en baseline hjertefrekvens (f.eks. RHR) for hvert dyr. Figur 5B og figur 6B viser 10 s lang hjertestans forårsaket av Hand>eNpHR2.0-aktivering ved bruk av rødt lys (617 nm) i henholdsvis larve og puppe. Da det røde lyset ble slått på, sluttet Drosophilas hjerte å slå og forble i denne tilstanden til slutten av lysbelysningen. Hjertefunksjonen ble gjenopprettet etter at det røde lyset ble slått av. Dyr som ikke hadde opsin uttrykt (“no opsin” kontroll) reagerte ikke på rødlysbelysningen (supplerende figur 2A og supplerende figur 3A). Kontrollforsøkene med Hand>eNpHR2.0 dyr der 10 s rødt lysbelysning ikke var slått på (“ingen lys”-kontroll) viste at hjertet slo normalt (supplerende figur 4A og supplerende figur 4C). Ved hjelp av Hand>eNpHR2.0 ble det påført røde lyspulser ved frekvenser lavere enn RHR. Hjertets kontraksjonsfrekvens ble redusert etter lyssignalene; denne langsommere hjertefrekvensen etterligner en type hjertearytmi, bradykardi (figur 5C og figur 6C for henholdsvis larve og puppe). Den langsommere hjerterytmen ble ikke observert i “no opsin” (supplerende figur 2B og supplerende figur 3B) og i “ingen lys” (supplerende figur 4A og supplerende figur 4C) kontrolleksperimenter. Økning av hjertefrekvensen kan oppnås ved å aktivere Hand>ReaChR opsin med rødt lys pulstog med en frekvens høyere enn RHR for det gitte dyret. En serie på tre lyspulstog ved forskjellige stimuleringsfrekvenser (f.eks. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) ble påført Hand>ReaChRlarver og pupper. De oppnådde dataene viser tydelig økt hjertefrekvens etter lyspulsene (figur 5D og figur 6D for henholdsvis larve og puppe). Hjertesykdommen demonstrert i disse forsøkene etterligner takykardi. Negative kontrolleksperimenter er vist i supplerende figur 2C, supplerende figur 3C og supplerende figur 4B, D. Samlet sett viser resultatene muligheten for ikke-invasiv og spesifikk optogenetisk kontroll av hjerterytmen i ulike utviklingsstadier i transgene dyremodeller av D. melanogaster. Figur 1: OCT bildesystem integrert med 617 nm LED-modul for optogenetisk kontroll av Drosophila hjertefunksjon . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: Generere D. melanogaster dyr som uttrykker opsin i hjertet. (A) Genetisk kryssdiagram. Kvinner Hand-GAL4/TM6 SbTb ble krysset til menn som bærer eNpHR2.0. Det resulterende Hand-GAL4/eNpHR2.0-avkommet (merket med den røde stjernen) ble samlet inn for OCT-avbildning, og Hand-GAL4/TM6 Sb Tb ble kassert basert på deres fenotypiske utseende. (B) Genetisk kryssdiagram. Hunnene Hand-GAL4/TM6 SbTb ble krysset til hanner som bar ReaChR. Det resulterende Hand-GAL4/ReaChR-avkommet (merket med den røde stjernen) ble samlet inn for OCT-avbildning, og Hand-GAL4/TM6 Sb Tb ble kassert basert på deres fenotypiske utseende. (C) Fenotypiske forskjeller mellom Hand-GAL4/opsin (rød stjerne) og Hand-GAL4/TM6 Tb avkom. Dyr som bærer Tb-genmutasjonen på TM6-kromosomet har en “tubby” kroppsform sammenlignet med normal, ikke-Tb larve eller puppe. Det venstre panelet viser larver; det høyre panelet viser tidlige pupper. Bilder inkluderer også en linjal med 1 mm merker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: Skjematisk presentasjon og tidslinje for prosedyrene for bildebehandling. Foreldreaksjer oppbevares i flueflasker; jomfruhunner og menn krysses i smale hetteglass fylt med vanlig mat (indikert med gul farge). Aktivt eggleggende fluer overføres til ATR-holdige medier (vist i brune) hetteglass. Hetteglass med utviklende avkom må holdes i mørket fra dette trinnet. 3. instar larver og tidlig puppe samles fra hetteglassveggene for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: D. melanogaster tidlig puppe som uttrykker UAS-GFP (BDSC 6658) drevet av Hand-GAL4 (BDSC 48396). Fluorescensmønsteret bekrefter hjertespesifisiteten til Hand-GAL4-driveren . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: Simulering av hjertestans, bradykardi og takykardi i D. melanogaster larve. (A) OCT-bilde av et larvekroppstverrsnitt. Hjertet vises som en sirkel under kroppens overflate. (B) Grafisk presentasjon av hjertestansen som kan gjenopprettes. Det øvre panelet viser tidspunktet (X-aksen) for rødlysbelysningen (Y-aksen, lyskildens effektnivåprosent). Det midterste panelet indikerer endringen i hjerteområdet (Y-aksen, kvadratmikrometer) over tid (X-aksen). Det nedre panelet viser hjertefrekvensendringen (Y-aksen, hertz) over tid (X-aksen). (C) Grafisk presentasjon av eNpHR2.0-mediert restaurerbar bradykardi. Det øvre panelet viser pulser av rødlysbelysningen, noe som induserer to perioder med bradykardi: 50% av RHR og 25% av RHR. Hjertefrekvens og hjertefrekvensendringer vises på henholdsvis midtre og nedre panel. (D) Grafisk presentasjon av hjertets tempo ved aktivert ReaChR. Det øvre panelet viser en serie med 20 ms røde lyspulser som forekommer ved RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjertekontraksjonene følger lyspulsfrekvensene, som vist på midtre og nedre paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 6: Simulering av hjertestans, bradykardi og takykardi i D. melanogaster puppe . (A) OCT-bilde av puppens kroppstverrsnitt. Hjertet vises som en sirkel under kroppens overflate. (B) Grafisk presentasjon av hjertestansen som kan gjenopprettes. Det øvre panelet viser tidspunktet (X-aksen) for rødlysbelysningen (Y-aksen, lyskildens effektnivåprosent). Det midterste panelet indikerer endringen i hjerteområdet (Y-aksen, kvadratmikrometer) over tid (X-aksen). Det nedre panelet viser hjertefrekvensendringen (Y-aksen, hertz) over tid (X-aksen). (C) Grafisk presentasjon av eNpHR2.0-mediert restaurerbar bradykardi. Det øvre panelet viser pulser av rødlysbelysningen, noe som induserer to perioder med bradykardi: 50% av RHR og 25% av RHR. De midterste og nedre panelene viser henholdsvis hjerteområdet og hjertefrekvensendringer. (D) Grafisk presentasjon av hjertets tempo ved aktivert ReaChR. Det øvre panelet viser en serie med 20 ms røde lyspulser ved RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjertekontraksjonene følger frekvensene til lyspulsen, som vist på midtre og nedre paneler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Supplerende figur 1: Genetiske kryss for å erstatte TM3 Sb balancer kromosom med TM6 Sb Tb. Virgin kvinner Hand-GAL4 w + / TM3 Sb ble krysset med nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w + / TM6 Sb Tb hanner. Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb avkom, inkludert jomfru kvinner og menn, ble valgt (screening for pigmenterte øyne kombinert med tubby kroppsform). Utvalgte fluer ble selvkrysset for å etablere en stabil bestand. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende figur 2: I kontrolleksperimenter endres ikke hjerterytmen til villtypen (wt) ved rødt lysbelysning. (A) Ingen hjertestans ble observert under rødlysbelysningen i wt-larven. Det øvre panelet viser hjertebildene i M-modus. Den røde linjen angir belysningstidspunktet. De midterste og nedre panelene viser hjerteområdet og hjertefrekvensen i løpet av 32 s bildetid. (B,C) Røde lyspulser endrer ikke hjertefrekvensen i wt larve. De øvre panelene viser hjertebildene i M-modus. Den røde linjen angir belysningstidspunktet. De midterste og nedre panelene viser hjerteområdet og hjertefrekvensen i løpet av 32 s bildetid. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende figur 3: I kontrolleksperimenter endres ikke villtypen (wt) puppens hjerterytme ved rødt lysbelysning. (A) Ingen hjertestans ble observert under rødlysbelysningen i wt-larven. Det øvre panelet viser hjertebildene i M-modus. Den røde linjen angir belysningstidspunktet. De midterste og nedre panelene viser hjerteområdet og hjertefrekvensen i løpet av 32 s bildetid. (B,C) Røde lyspulser endrer ikke hjertefrekvensen i wt pupa. De øvre panelene viser hjertebildene i M-modus. Den røde linjen angir belysningstidspunktet. De midterste og nedre panelene viser hjerteområdet og hjertefrekvensen i løpet av 32 s bildetid. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende figur 4: D. melanogasterlarver og pupper som uttrykker Hand> eNpHR2.0 eller Hand>ReaChR viser ikke signifikante HR-endringer under OCT-avbildning uten rødt lysbelysning. (A) Hjertefrekvensen til Hand>eNpHR2.0 larve. (B) Hjertefrekvensen til Hand>ReaChR larven. (C) Hjertefrekvensen til Hand>eNpHR2.0 puppe. (D) Hjertefrekvensen til Hand>ReaChR pupa. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. Supplerende video 1: Aktivert eNpHR2.0 forårsaker hjertestans i D. melanogaster larve. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende video 2: Aktivert eNpHR2.0 forårsaker hjertestans i D. melanogaster pupa. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende video 3: eNpHR2.0-mediert restaurerbar bradykardi i D. melanogasterlarve. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende video 4: eNpHR2.0-mediert gjenopprettelig bradykardi i D. melanogaster pupa. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende video 5: Hjertetempo ved aktivert ReaChR i D. melanogaster larve. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende Video 6: Heart pacing av aktivert ReaChR i D. melanogaster puppe. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Sammenlignet med våre tidligere rapporter hvor uttrykket av opsiner ble drevet ikke bare i hjertet, men også i det omkringliggende muskelvevet, rapporterer det nåværende arbeidet ved hjelp av en hjertespesifikk driver, Hand-GAL4. Denne nye Hand> opsin genetiske konfigurasjonen som brukes til optogenetisk hjerteregulering, bekrefter ytterligere tidligere rapporterte resultater og etablerer en bedre Drosophila kardiovaskulær forskningsmodell.

Medieforberedelse er avgjørende for eksperimentenes suksess. Opsinproteiner krever en ligand, all-trans retinal (ATR), for å fungere²⁸. Fluer produserer ikke nok ATR, så ATR må suppleres til fluemediet. I denne studien ble den tidligere rapporterte hurtigmaten erstattet med semi-definerte medier²⁹. Den nye oppskriften på ATR-holdige medier ble introdusert for å sikre en jevn fordeling av ATR. ATR er ikke løselig i vann; Når etanolbasert 100 mM ATR-lager tilsettes vannbaserte medier, dispergeres det ved å virvle hetteglassene som inneholder varme semi-definerte medier. Den tidligere rapporterte ATR-konsentrasjonen ble også redusert fra 10 mM for eNpHR2.0 og 3 mM for ReaChR²² til en sluttkonsentrasjon på 1 mM for begge. Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig til å sikre riktig eNpHR2.0- og ReaChR-funksjon.

En viktig del av den eksperimentelle suksessen er den forbedrede databehandlingen med FlyNet 2.0²⁷. Laboratoriet har fortsatt å utvikle denne programvaren for å forbedre både beregningseffektiviteten og nøyaktigheten til den automatiserte flyhjertesegmenteringsalgoritmen. Tverrsnittsmaskene produsert av denne programvaren brukes til å utlede Drosophila fysiologiske data som fraksjonell forkortelse og hjertevegghastighet. Denne tilnærmingen har muliggjort effektiv dataanalyse med minimalt menneskelig tilsyn, noe som gjør det raskere og mer pålitelig å karakterisere hjertefunksjonen for datasett med stor fluehjerteavbildning.

Myokardinfarkt er fortsatt den ledende dødsårsaken, og myokardiskemi bidrar til to tredjedeler av alle tilfeller av hjertesvikt, som raskt dukker opp blant de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet i USA³⁰. Utviklingen av nye terapier og medisinsk utstyr krever dyp kunnskap om mekanismene for hjertesykdommer på fysiologiske og biokjemiske nivåer. Disse målene kan oppnås ved hjelp av modellorganismer. D. melanogaster har etablert seg som en av de mest pålitelige og effektive modellene 31,32,33,34,35. Dette arbeidet har generert de simulerte Drosophila hjertesykdomsmodellene indusert av en ikke-invasiv optogenetisk tilnærming. Utviklingen av ikke-invasive optiske hjerte pacing teknologier gir grunnlag for å utvikle et alternativ til tradisjonelle elektriske hjerte pacing enheter. Ved å bruke OCT til å observere hjertefunksjonen i sanntid, kan studier nøyaktig karakterisere relevant hjertefysiologi i Drosophila-modeller for avanserte undersøkelser, inkludert screening av legemiddelkandidater. OCT-avbildning har en penetrasjonsdybde på ~ 1 mm, noe som fungerer bra for Drosophila hjertestudier, men begrenser bruken til å karakterisere hjertefunksjon i større dyremodeller. Videre er det en utfordring å oversette Drosophila-forskningen direkte til pattedyrmodeller. Nye optogenetiske verktøy må utvikles for å forbedre opsinenes følsomhet og oversette dem til ulike modellsystemer, inkludert sebrafisk, mus, rotter og humane hjerteorganoider, for kardiovaskulær forskning.

Materials

All-trans retinal	Cayman Chemicals	18449
Bacto Peptone	Gibco	02-10-2025
BioLED Light Source Control Module, 4-channel	Migtex Systems	BLS-SA04-US	Part of the optogenetic stimulation module
Broadband Light Source Module	Superlum	cBLMD-T-850-HP	Part of the SD-OCT imaging system
Cobra-S 800 OCT Spectrometers	Wasatch Photonics	CS800-840/180-80-OC2K-U3	Part of the SD-OCT imaging system
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professtional	34155	tissues
Drosophila agar	Genesee Scientific	66-103
Drosophila culture bottles	Genesee Scientific	32-131
FlyNet 2.0 Software	Z-Lab		Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab
High-Power LED Collimator Sources	Migtex Systems	BLS-LCS-0617-03-22	Part of the optogenetic stimulation module
Inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-106
Microscope slides	AmScope	BS-72P
Narrow plugs for Drosophila culture	Genesee Scientific	59-200
Narrow vials for Drosophila culture	Genesee Scientific	32-116SB
Permanent double-sided tape	Scotch
Plugs for Drosophila bottles	Genesee Scientific	59-194
Propionic Acid	Sigma	P1386-1L
SD-OCT control software	Z-Lab		Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system	Z-Lab		Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)
Sucrose	Carolina	89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 41752	eNpHR2.0 transgenic line
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 53748	ReaChR transgenic line
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1]	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock # 48396	Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	stock #6658	GFP reporter line
Yeast extract	Lab Scientific bioKEMIX	978-907-4243