쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화
Summary
상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.
Abstract
신경근 접합부 (NMJ)는 운동 뉴런에서 골격근으로의 신호 전달을 담당하는 복잡한 구조이며 시냅스 전 운동 축삭 말단, 시냅스 후 니코틴 아세틸 콜린 수용체 (AchRs) 및 시냅스 주위 슈완 세포 (PSCs)의 세 가지 필수 조직 학적 구성 요소로 구성됩니다. NMJ의 형태학적 특성을 입증하기 위하여, 래트 내측 위장관근을 표적 조직으로 선정하고, 운동 신경 섬유 및 이들의 시냅스 전 말단에 대한 뉴로필라멘트 200(NF200) 및 수포성 아세틸콜린 수송체(VAChT)를 포함하는 다양한 종류의 바이오마커와 함께 다중 형광 염색을 사용하여 시냅스 후 니코틴 AchRs에 대한 알파-분가로톡신(α-BTX)을 조사하고, 및 PSC에 대한 S100. 이 연구에서, 염색은 두 그룹으로 수행되었다: 첫 번째 그룹에서, 샘플은 NF200, VAChT, 및 α-BTX로 염색되었고, 두 번째 그룹에서는 샘플을 NF200, α-BTX 및 S100으로 염색하였다. 두 프로토콜 모두 NMJ의 상세한 구조를 효과적으로 입증할 수 있음을 보여주었다. 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체 및 PSC의 형태 학적 특성을 관찰하고 Z 스택 이미지를 입체 패턴으로 재구성하여 다른 라벨링 간의 공간 상관 관계를 추가로 분석했습니다. 방법론의 관점에서, 이들 프로토콜은 생리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 조사하기 위한 유용한 참고문헌을 제공하며, 이는 또한 말초 신경 손상 및 재생과 같은 NMJ의 병리학적 변경을 평가하는데 적합할 수 있다.
Introduction
신경 근 접합부(NMJ)1,2,3,4의 3가지 필수 구조적 성분으로서, 시냅스 전 운동 축삭 말단의 형태학적 측면, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AchRs)를 함유하는 시냅스 후 막, 및 시냅스 주위 슈완 세포(PSCs)가 광범위하게 조사되었다. 골격근의 얇은 절편 및 전체 탑재 표본은 전자 현미경 5,6, 공초점 현미경 7,8 및 광 시트 현미경 9,10과 같은 다른 조직학적 기술로 검사되었습니다. NMJ의 형태학적 특성이 상이한 측면에서의 이들 기술에 의해 입증되었지만, 비교로서, 공초점 현미경은 여전히 NMJ의 상세한 형태학의 이미징을 위한 이상적인 선택이다.
최근에는 NMJ의 구조적 성분을 보여주기 위한 많은 신기술이 개발되고 있다. 예를 들어, thy1-YFP 트랜스제닉 형광 마우스는 생체내 및 시험관내10,11에서 운동 축삭 및 운동 말단 플레이트를 관찰하는데 직접 사용되어 왔다. 추가적으로, 형광 α-BTX의 정맥내 주사는 광시트 현미경 9,12로 검사하기 위해 조직 광학 클리어링 치료를 사용하여 야생형 및 트랜스제닉 형광 마우스의 전체 탑재 골격근에서 모터 엔드 플레이트의 공간적 분포를 밝히기 위해 적용되었다. 그러나 이러한 고급 방법으로 볼 수있는 시냅스 전후 요소 외에도 PSC를 동시에 시연 할 수 없습니다.
축적 증거는 말초 신경교 세포로서 PSCs가 NMJ의 발달 및 안정성, 생리적 조건 하에서 NMJ의 시냅스 활성의 조절, 신경 손상 후 NMJ의 재생에 기여하는 시냅스 전 말단과 밀접하게 관련되어 있음을 나타냅니다13,14,15 . NMJ의 세포 구조를 고려할 때, 이 프로토콜은 PSC, 시냅스 전후 및 사후 요소를 동시에 표지하는 적절한 후보이며, 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 완전성 및 가소성을 평가하는데 잠재적으로 사용된다. 예를 들어, NMJ의 강도, 시냅스 후 운동 말단판의 형태학 및 부피, NMJ의 신경과민 및 탈핵, 생리적 및 병리학적 상태의 근육에서의 PSC의 수를 비교한다.
위장관 근육은 종아리에서 부풀어 오르는 가장 큰 근육으로, 사지에서 피부와 이두박근 대퇴골 근육을 제거하여 쉽게 해부됩니다. 근육은 종종 근육 위축, 신경근 변성, 근육 성능 및 운동 유닛 힘을 생체외 또는 생체내 16,17,18에서 평가하기 위해 선택된다. 그러나, 상기 기술은 또한 다양한 골격근으로부터 NMJ의 형태학적 특성을 드러내는데 적합하다. 동시에, 두꺼운 근육 절편은 얇은 절편(7,8) 및 놀린 근섬유(19)에 비해 NMJ의 더 완전한 형태학 및 양을 나타낼 수 있다.
이들 연구에 따라, 래트 내측 위장관 근육을 본 연구에서 표적 조직으로 선택하였고, NMJ의 구조적 성분에 따라 다양한 종류의 바이오마커로 다중 형광 염색을 위해 80 μm의 두께로 슬라이스하였다. 여기서, 뉴로필라멘트 200(NF200)20,21, 수포아세틸콜린 수송체(VAChT)22, 알파-분가로톡신(α-BTX)23,24, 및 S10025,26을 각각 신경섬유, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 AchRs, 및 PSCs를 표지하는데 사용하였다. 또한, 근육 조직 및 세포 핵의 배경은 팔로이드인 및 DAPI로 추가로 역염색되었다.
이 연구에서, 우리는 NMJ의 세포 구조를 더 두꺼운 고정 표본에 상응하는 바이오마커와 동시에 염색하기위한 정제 된 프로토콜을 개발할 것으로 기대하며, 이는 공초점 현미경 검사에 사용하기에 더 편리하며 PSC의 상세한 구조, 시냅스 전후 요소의 세부 구조 및 서로에 대한 공간적 상관 관계에 대한 훨씬 더 많은 정보를 얻는 데 도움이됩니다. 방법론의 관점에서, 이 프로토콜은 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 평가하는 데 도움이 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 근육 절편의 성공적인 다중 염색을 수행하고 쥐 내측 위장관 근육의 두꺼운 절편에서 NMJ의 형태학적 특성을 드러내기 위한 형광 면역조직화학의 사용에 필요한 기술적 세부사항을 기술하였다. 이 접근법을 사용함으로써, PSCs와 사전 및 사후 시냅스 요소의 미세한 세부 사항 및 공간 상관관계가 공초점 현미경 하에서 분석되고 평가될 수 있고, 입체 패턴으로 추가로 재구성될 수 있다. 여기…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 CACMS 혁신 기금 (아니오. CI2021A03407), 중국 국립자연과학재단(제82004299호), 중앙공공복지연구소 기초연구기금(제호. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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