Observação do Comportamento Fotográfico em Clamídomonas reinhardtii
Summary
A maioria dos organismos fotoautotróficos da natação apresentam alterações comportamentais induzidas por foto (comportamento fotográfico). O presente protocolo observa o referido comportamento fotográfico no organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Para a sobrevivência dos microrganismos fototróficos motile, estar sob condições adequadas de luz é crucial. Consequentemente, eles mostram comportamentos induzidos por foto (ou comportamento fotográfico) e alteram sua direção de movimento em resposta à luz. Os comportamentos típicos de fotobehtos incluem resposta fotofóbica (ou fotofóbica) e fototaxis. Photoshock é uma resposta a uma mudança repentina na intensidade da luz (por exemplo, iluminação de flash), onde organismos param de se mover ou se movem para trás. Durante a fototaxis, os organismos se movem em direção à fonte de luz ou na direção oposta (chamada fototáxi positiva ou negativa, respectivamente). A alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii é um excelente organismo para estudar o comportamento fotográfico porque muda rapidamente seu padrão de natação modulando a batida de cílios (também conhecido como flagela) após a fotorrecepção. Aqui, vários métodos simples são mostrados para observar os comportamentos fotofoitos em C. reinhardtii. Pesquisas sobre os comportamentos fotográficos de C. reinhardtii levaram à descoberta de mecanismos regulatórios comuns entre cílios eucarióticos e channelrhodopsins, o que pode contribuir para uma melhor compreensão das ciliopatias e o desenvolvimento de novos métodos optogenéticos.
Introduction
A luz é uma fonte de energia indispensável para organismos fotossintéticos, mas muita luz pode causar danos foto-oxidativos. Assim, os organismos fototróficos precisam sobreviver sob luz de intensidade moderada, onde podem fotossintestar, mas não sofrer danos foto-oxidativos1. Em plantas terrestres, cloroplastos não podem sair da folha e mostrar movimentos fotográficos na célula; cloroplastos se movem para a periferia da célula sob alta luz e a superfície celular sob baixa luz2, enquanto muitas algas motile mostram comportamentos fotográficos que lhes permitem encontrar condições adequadas de luz para fotossíntese e, assim, facilitam sua sobrevivência3.
Clamídoonas reinhardtii é uma alga verde unicelular considerada como um organismo modelo em campos de pesquisa como cílio (também conhecido como flagela), fotossíntese e comportamento fotográfico. C. reinhardtii apresenta uma mancha operária e duas cílias por célula, usadas para fotorecepção e natação, respectivamente. A mancha olenta tem dois componentes: canalrhodopsinas (ChRs), canais de íons com a luz na membrana plasmática, e as camadas de grânulo ricas em carotenoides localizadas logo atrás dos ChRs. A mancha olhenta atua como um receptor de luz direcional, uma vez que as camadas de grânulo ricas em carotenoides funcionam como um refletor de luz 4,5.
As RS foram inicialmente identificadas como fotorreceptores causando comportamentos fotográficos em C. reinhardtii 6,7,8,9. Embora dois isoformes, ChR1 e ChR2, sejam encontrados na mancha obentou, experimentos de knock-down mostraram que ChR1 é o principal fotorreceptor para fotobehaviors10. Apesar disso, o ChR2 tem recebido mais atenção e desempenhado um papel central no desenvolvimento da optogenética, uma técnica para controlar a excitação celular pela luz11. Portanto, estudar os mecanismos regulatórios que regem os comportamentos fotográficos em C. reinhardtii irá promover a compreensão da função chr e melhorar a optogenética.
Após a fotorrecepção, as células C. reinhardtii mostram dois tipos de comportamentos fotográficos: fototaxis e resposta ao choquede fotos 12. Fototaxis é o comportamento das células nadando na direção da fonte de luz ou na direção oposta, chamada fototáxi positiva ou negativa, respectivamente. Resposta de photoshock é um comportamento que as células mostram depois de sentir uma mudança repentina na intensidade da luz, como quando iluminada por um flash. As células param de nadar ou nadam para trás (ou seja, nadando com o corpo celular para a frente) por um curto período, normalmente <1 s.
Movimentos ciliares em C. reinhardtii estão envolvidos em seus comportamentos fotográficos. Dois cílios geralmente batem como nado de peito de um humano, e isso é modulado para fotofossores. Para fototaxis, as forças geradas pelas duas cílios são desequilibrados pela modulação da frequência de batida e pela amplitude de forma de onda de cada círio13. O cílio mais próximo da mancha é chamado cílio cis, e o outro é chamado de trans cilium. Estes dois cilia diferem em vários pontos. Por exemplo, a frequência de batimentos ciliar de trans cilium in vitro é 30%-40% maior14. Além disso, sua sensibilidade ca2+ é diferente. A reativação dos modelos de células demembradas15 mostrou que o círio cis bate mais fortemente do que o cilium trans para Ca2+ <1 x 10-8 M, enquanto o oposto é verdadeiro para Ca2+ >1 x 10-7 M. Essa assimetria na sensibilidade ca2+ é possivelmente importante para as curvas fototáticas, uma vez que mutantes sem essa assimetria não exibem fototaxis normais16,17. Por outro lado, a conversão de forma de onda é necessária para o choque de fotos. A forma de onda ciliar se transforma da forma de onda assimétrica na natação dianteira para a forma de onda simétrica na natação retrógrada. Esta conversão de forma de onda também é regulada por Ca2+, em um limiar de 1 x 10-4 M18,19. Uma vez que os defeitos na regulação dos movimentos ciliares causam diskinesia ciliar primária em humanos, estudar comportamentos fotográficos em C. reinhardtii pode ajudar na melhor compreensão dessas doenças e desenvolvimentos terapêuticos20.
Aqui, são demonstrados quatro métodos simples para observar os comportamentos fotográficos em C. reinhardtii . Primeiro, um ensaio de fototaxis usando placas de Petri é mostrado, e segundo, um ensaio de fototaxis contra gotículas de suspensão celular. O fenômeno observado em ambos os casos não é estritamente fototaxis, mas o acúmulo de fotos, onde as células tendem a se acumular perto do lado da fonte de luz ou do lado oposto. Em C. reinhardtii, o acúmulo de fotos é causado principalmente por fototaxis de uma forma que pode ser usada como aproximação à fototaxis. Em terceiro lugar, um ensaio mais rigoroso para fototátega sob um microscópio é mostrado, e por último é um ensaio de fotoshock sob um microscópio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo é fácil e não demorado. Se um mutante C. reinhardtii é suspeito de apresentar defeitos em fotorrecepção ou movimento ciliar, este método pode servir como análise fenotípica primária.
No entanto, existem alguns passos críticos. Uma delas é usar células no experimento na fase inicial e intermediária de crescimento do registro. Após a cultivo por longos períodos, as células tornam-se menos motile, menos sensíveis à luz, e até mesmo formam palmello…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por bolsas da Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) para NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) e KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), da Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) à KW, e da Aliança Dinâmica para Inovação Aberta Conectando Humanos, Ambientais e Materiais (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) à NU, TH e KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
Referências
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