Наблюдение за фотоповедением в Chlamydomonas reinhardtii
Summary
Большинство плавающих фотоавтотрофных организмов демонстрируют фотоиндуцированные поведенческие изменения (фотоповедение). Настоящий протокол наблюдает указанное фотоповедение в модельном организме Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Для выживания подвижных фототрофных микроорганизмов решающее значение имеет нахождение в надлежащих условиях освещения. Следовательно, они показывают поведение, вызванное фотографией (или фотоповедение) и изменяют направление движения в ответ на свет. Типичные фотоповедения включают фотошок (или фотофобную) реакцию и фототаксис. Фотошок — это реакция на внезапное изменение интенсивности света (например, вспышка освещения), при котором организмы временно перестают двигаться или движутся назад. Во время фототаксиса организмы движутся к источнику света или в противоположном направлении (называемом положительным или отрицательным фототаксисом соответственно). Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii является отличным организмом для изучения фотоповедения, поскольку она быстро меняет свой характер плавания, модулируя биение ресничек (также известных как жгутики) после фоторецепции. Здесь показаны различные простые методы наблюдения за фотоповедением у C. reinhardtii. Исследования фотоповедения C. reinhardtii привели к открытию общих регуляторных механизмов между эукариотическими ресничками и канальными родопсинами, что может способствовать лучшему пониманию цилиопатий и разработке новых методов оптогенетики.
Introduction
Свет является незаменимым источником энергии для фотосинтезирующих организмов, но слишком много света может вызвать фотоокислительное повреждение. Таким образом, фототрофные организмы должны выживать при свете умеренной интенсивности, где они могут фотосинтезировать, но не страдать от фотоокислительного повреждения1. В наземных растениях хлоропласты не могут выходить из листа и показывать фотодвижения в клетке; хлоропласты перемещаются на периферию клетки при сильном освещении и на поверхность клетки при слабом освещении2, тогда как многие подвижные водоросли демонстрируют фотоповедение, которое позволяет им находить надлежащие условия освещения для фотосинтеза и, таким образом, облегчают их выживание3.
Chlamydomonas reinhardtii – это одноклеточные зеленые водоросли, рассматриваемые как модельный организм в таких областях исследований, как реснички (также известные как жгутики), фотосинтез и фотоповедение. C. reinhardtii имеет одно глазное пятно и две реснички на клетку, используемые для фоторецепции и плавания соответственно. Глазное пятно имеет два компонента: канальныеродопсины (ChRs), световые ионные каналы в плазматической мембране и богатые каротиноидами гранулярные слои, расположенные прямо за ChRs. Глазное пятно действует как рецептор направленного света, поскольку богатые каротиноидами гранулярные слои функционируют как светоотражатель 4,5.
ChRs были первоначально идентифицированы как фоторецепторы, вызывающие фотоповедение у C. reinhardtii 6,7,8,9. Хотя две изоформы, ChR1 и ChR2, обнаружены в глазном пятне, эксперименты показали, что ChR1 является основным фоторецептором для фотоповедения10. Несмотря на это, ChR2 получил больше внимания и сыграл центральную роль в развитии оптогенетики, техники контроля возбуждения клеток светом11. Таким образом, изучение регуляторных механизмов, регулирующих фотоповедение у C. reinhardtii, будет способствовать пониманию функции ChR и улучшению оптогенетики.
После фоторецепции клетки C. reinhardtii показывают два типа фотоповедения: фототаксис и фотошоковый ответ12. Фототаксис — это поведение клеток, плавающих в направлении источника света или в противоположном направлении, называемое положительным или отрицательным фототаксисом соответственно. Реакция фотошока — это поведение, которое клетки демонстрируют после внезапного изменения интенсивности света, например, при освещении вспышкой. Клетки перестают плавать или плыть назад (т.е. плавают с телом клетки вперед) в течение короткого периода, обычно <1 с.
Цилиарные движения у C. reinhardtii участвуют в его фотоповедении. Две реснички обычно бьются, как при плавании человека брассом, и это модулируется для фотоповедения. Для фототаксиса силы, генерируемые двумя ресничками, несбалансированы модуляцией частоты биения и амплитуды формы волны каждой реснички13. Ресничка, ближайшая к глазному пятну, называется цис-ресничкой, а другая называется транс-ресничкой. Эти две реснички различаются по разным пунктам. Например, частота цилиарного биения реснички in vitro на 30%-40% выше14. Кроме того, их чувствительность Ca2+ отличается. Реактивация моделей15 демембранированных клеток показала, что цис-ресничка бьется сильнее, чем транс-ресничка для Ca2+ <1 x 10−8 M, в то время как для Ca2+ >1 x 10−7 M верно обратное. Эта асимметрия в чувствительности Ca2+, возможно, важна для фототаксических поворотов, поскольку мутанты, лишенные этой асимметрии, не проявляют нормального фототаксиса16,17. И наоборот, преобразование формы сигнала необходимо для фотошока. Цилиарная форма сигнала преобразуется из асимметричной формы сигнала в прямом плавании в симметричную форму волны в обратном плавании. Это преобразование формы сигнала также регулируется Ca2+, при пороге 1 x 10−4 M18,19. Поскольку дефекты в регулировании цилиарных движений вызывают первичную цилиарную дискинезию у людей, изучение фотоповедения у C. reinhardtii может помочь в лучшем понимании этих заболеваний и терапевтических разработок20.
Здесь демонстрируются четыре простых метода наблюдения фотоповедения у C. reinhardtii . Во-первых, показан фототаксисный анализ с использованием чашек Петри, а во-вторых, фототаксисный анализ на наличие капель клеточной суспензии. Явление, наблюдаемое в обоих случаях, не является строго фототаксисом, а фотоаккумуляцией, где клетки имеют тенденцию накапливаться близко к стороне источника света или противоположной стороне. У C. reinhardtii накопление фотографий в основном вызвано фототаксисом таким образом, что может быть использовано в качестве приближения к фототаксису. В-третьих, показан более строгий анализ фототаксиса под микроскопом, и последний – фотошок под микроскопом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол прост и не отнимает много времени. Если мутант C. reinhardtii подозревается в наличии дефектов фоторецепции или цилиарного движения, этот метод может служить в качестве первичного фенотипического анализа.
Тем не менее, некоторые критические шаги сущес?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Японского общества содействия развитию науки KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) для NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) и KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), от Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) до KW и от Динамического альянса за открытые инновации, соединяющие человека, окружающую среду и материалы (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) с NU, TH и KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
Referências
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. Photoreception and photomovements of microorganisms. Photochemical & Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D. Light antennas in phototactic algae. Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas. Genética. 149 (2), 927-936 (1998).
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. . in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
