Observación del fotoconducto en Chlamydomonas reinhardtii
Summary
La mayoría de los organismos fotoautótrofos que nadan muestran cambios de comportamiento fotoinducidos (fotocomportamiento). El presente protocolo observa dicho fotocomportamiento en el organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Para la supervivencia de los microorganismos fotótrofos móviles, es crucial estar en condiciones de luz adecuadas. En consecuencia, muestran comportamientos fotoinducidos (o fotoconducto) y alteran su dirección de movimiento en respuesta a la luz. Los fotoconductos típicos incluyen respuesta de fotochoque (o fotofóbico) y fototaxis. El fotoshock es una respuesta a un cambio repentino en la intensidad de la luz (por ejemplo, iluminación del flash), en el que los organismos dejan de moverse transitoriamente o retroceden. Durante la fototaxis, los organismos se mueven hacia la fuente de luz o en la dirección opuesta (llamada fototaxis positiva o negativa, respectivamente). El alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii es un organismo excelente para estudiar el fotoconducto porque cambia rápidamente su patrón de natación modulando el latido de los cilios (también conocidos como flagelos) después de la fotorrecepción. Aquí, se muestran varios métodos simples para observar fotocomportadores en C. reinhardtii. La investigación sobre los fotoconductos de C. reinhardtii ha llevado al descubrimiento de mecanismos reguladores comunes entre los cilios eucariotas y las canalrodopsinas, que pueden contribuir a una mejor comprensión de las ciliopatías y al desarrollo de nuevos métodos optogenéticos.
Introduction
La luz es una fuente de energía indispensable para los organismos fotosintéticos, pero demasiada luz puede causar daño foto-oxidativo. Por lo tanto, los organismos fototróficos necesitan sobrevivir bajo luz de intensidad moderada, donde pueden fotosintetizar pero no sufrir daño foto-oxidativo1. En las plantas terrestres, los cloroplastos no pueden salir de la hoja y mostrar movimientos fotográficos en la célula; Los cloroplastos se desplazan a la periferia de la célula bajo alta luz y a la superficie celular bajo poca luz2, mientras que muchas algas móviles muestran fotoconductos que les permiten encontrar condiciones de luz adecuadas para la fotosíntesis y, por lo tanto, facilitan su supervivencia3.
Chlamydomonas reinhardtii es un alga verde unicelular considerada como un organismo modelo en campos de investigación como cilios (también conocidos como flagelos), fotosíntesis y fotoconducto. C. reinhardtii se presenta con una ojera y dos cilios por célula, utilizados para la fotorrecepción y la natación, respectivamente. La mancha ocular tiene dos componentes: canalrodopsinas (ChR), canales iónicos dependientes de la luz en la membrana plasmática y las capas de gránulos ricos en carotenoides ubicadas justo detrás de los ChR. La mancha ocular actúa como un receptor de luz direccional ya que las capas de gránulos ricas en carotenoides funcionan como un reflector de luz 4,5.
Los ChR se identificaron inicialmente como fotorreceptores causantes de fotocomportamiento en C. reinhardtii 6,7,8,9. Aunque dos isoformas, ChR1 y ChR2, se encuentran en la mancha ocular, los experimentos de derribo mostraron que ChR1 es el fotorreceptor primario para los fotoconductos10. A pesar de esto, ChR2 ha recibido más atención y ha desempeñado un papel central en el desarrollo de la optogenética, una técnica para controlar la excitación celular por la luz11. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos reguladores que gobiernan los fotoconductos en C. reinhardtii promoverá la comprensión de la función ChR y mejorará la optogenética.
Después de la fotorrecepción, las células de C. reinhardtii muestran dos tipos de fotocomportadores: fototaxis y respuesta de fotochoque12. La fototaxis es el comportamiento de las células que nadan en la dirección de la fuente de luz o en la dirección opuesta, llamada fototaxis positiva o negativa, respectivamente. La respuesta de fotochoque es un comportamiento que las células muestran después de detectar un cambio repentino en la intensidad de la luz, como cuando se ilumina con un flash. Las células dejan de nadar o nadan hacia atrás (es decir, nadando con el cuerpo celular hacia adelante) durante un corto período, generalmente <1 s.
Los movimientos ciliares en C. reinhardtii están involucrados en sus fotocomportadores. Dos cilios generalmente laten como la natación de braza de un humano, y esto se modula para los fotocomportadores. Para los fototaxis, las fuerzas generadas por los dos cilios están desequilibradas por la modulación de la frecuencia de latido y la amplitud de la forma de onda de cada cilio13. El cilio más cercano a la mancha ocular se llama cilio cis, y el otro se llama cilio trans. Estos dos cilios difieren en varios puntos. Por ejemplo, la frecuencia de latido ciliar del transcilio in vitro es 30%-40% mayor14. Además, su sensibilidad a Ca2+ es diferente. La reactivación de los modelos de células desmembranadas15 mostró que el cilio cis late con más fuerza que el transcilio para Ca2+ <1 x 10−8 M, mientras que lo contrario es cierto para Ca2+ >1 x 10−7 M. Esta asimetría en la sensibilidad de Ca2+ es posiblemente importante para los giros fototácticos, ya que los mutantes que carecen de esta asimetría no exhiben fototaxisnormales 16,17. Por el contrario, la conversión de la forma de onda es necesaria para el fotoshock. La forma de onda ciliar se transforma de la forma de onda asimétrica en la natación hacia adelante a la forma de onda simétrica en la natación hacia atrás. Esta conversión de forma de onda también está regulada por Ca2+, en un umbral de 1 x 10−4 M18,19. Dado que los defectos en la regulación de los movimientos ciliares causan discinesia ciliar primaria en humanos, el estudio de los fotoconductos en C. reinhardtii podría ayudar a comprender mejor estas enfermedades y los desarrollos terapéuticos20.
Aquí, se demuestran cuatro métodos simples para observar fotocomportadores en C. reinhardtii . En primer lugar, se muestra un ensayo de fototaxis utilizando placas de Petri, y en segundo lugar, un ensayo de fototaxis contra gotas de suspensión celular. El fenómeno observado en ambos casos no es estrictamente fototaxis sino fotoacumulación, donde las células tienden a acumularse cerca del lado de la fuente de luz o del lado opuesto. En C. reinhardtii, la acumulación de fotos es causada principalmente por fototaxis de una manera que puede usarse como una aproximación a la fototaxis. En tercer lugar, se muestra un ensayo más riguroso para la fototaxis bajo un microscopio, y por último es un ensayo de fotoshock bajo un microscopio.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual es fácil y no requiere mucho tiempo. Si se sospecha que un mutante de C. reinhardtii presenta defectos en la fotorrecepción o el movimiento ciliar, este método podría servir como análisis fenotípico primario.
Sin embargo, existen algunos pasos críticos. Una es usar células en el experimento en la fase de crecimiento temprano a medio log. Después del cultivo durante largos períodos, las células se vuelven menos móviles, menos sensibles a la luz e incluso…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) a NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) y KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), de la Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) a KW, y de la Alianza Dinámica para la Innovación Abierta Uniendo Humano, Medio Ambiente y Materiales (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) a NU, TH y KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
Referências
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