En fotodynamisk tilgang til undersøgelse af funktionen af intracellulær vesikelbrud

Summary

AlPcS_2a-medieret kromoforassisteret laserinaktivering (CALI) er et kraftfuldt værktøj til at studere spatiotemporal skade på intracellulære vesikler (IV’er) i levende celler.

Abstract

Intracellulære vesikler (IV’er) dannes gennem endocytose af vesikler i cytoplasma. IV-dannelse er involveret i aktivering af forskellige signalveje gennem permeabilisering af IV-membraner og dannelse af endosomer og lysosomer. En metode ved navn kromoforassisteret laserinaktivering (CALI) anvendes til at studere dannelsen af IV’er og materialerne til styring af IV-regulering. CALI er en billeddannelsesbaseret fotodynamisk metode til at studere signalvejen induceret af membranpermeabilisering. Metoden tillader spatiotemporal manipulation af den valgte organel at blive permeabiliseret i en celle. CALI-metoden er blevet anvendt til at observere og overvåge specifikke molekyler gennem permeabilisering af endosomer og lysosomer. Membranbruddet af IV’er er kendt for selektivt at rekruttere glycanbindende proteiner, såsom galectin-3. Her beskriver protokollen induktionen af IV-brud af AlPcS_2a og brugen af galectin-3 som markør til mærkning af svækkede lysosomer, hvilket er nyttigt til at studere nedstrømsvirkningerne af IV-membranbrud og deres nedstrømsvirkninger under forskellige situationer.

Introduction

Endosomer, en type intracellulær vesikel (IV), dannes ved endocytose og modnes derefter til lysosomer. Forskellige intracellulære signalveje er involveret i dannelsen af IV’er; Derudover kan forskellige indre og ydre stimuli beskadige IV’er (f.eks. Patogener kan undslippe fra den afgrænsede membran under infektion og komme ind i cytoplasma¹). Dette ledsages normalt af brud på endocytotiske vesikler². Derfor kan teknikkerne til målretning og beskadigelse af IV’er anvendes i relaterede undersøgelser³.

Fotodynamisk terapi (PDT) er en lysafhængig terapi til bekæmpelse af sygdomme ved at dræbe tumorer eller patogener⁴. I PDT er målrettede celler mærket med ikke-toksiske kromoforer, kaldet fotosensibilisatorer, der kan aktiveres lokalt ved lysbelysning ^5,6. Fotosensibilisatorer absorberer energi fra lys og omdannes til en ophidset singlettilstand, hvilket fører til den langlivede ophidsede triplettilstand. Fotosensibilisatorer i triplettilstanden kan gennemgå elektron- eller energioverførsel og danne reaktive iltarter (ROS) i nærvær af ilt og kan rumligt ødelægge mærkede celler inden for belysningsområdet⁷. Konsekvensen varierer afhængigt af lysets kraft⁸. Ved at kontrollere koncentrationen af fotosensibilisatorer og intensiteten af lysbelysning kan målrettede biomolekyler selektivt inaktiveres uden cellelyse, betegnet som kromoforassisteret lysinaktivering (CALI)⁹. Med den betydelige udvikling af fotosensibilisatorer, der selektivt kan mærke forskellige subcellulære mål, er CALI blevet et værdifuldt værktøj til at kontrollere lysmedieret inaktivering af biomolekyler til små biomolekyler såsom nukleotider og proteiner samt organeller såsom mitokondrier og endolysosomer 3,10,11,12,13.

Sammenlignet med CALI anvendes kemiske eller fysiske metoder også til at forringe membraner, såsom bakterietoksin ^14,15 og Leu-Leu-OMe ^{16-behandling} for lysosomal skade. Imidlertid viser disse metoder bulkforringelse af IV’er i celler. Robuste fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)phthalocyaniddisulfonsyre (AlPcS_2a)) anvendes i CALI; AlPcS_2a, der målretter lysosomerne gennem endocytose, bruges til at sprænge endosomer eller lysosomer i et kontrolleret område¹⁷. AlPcS_2a er en cellemembran-uigennemtrængelig phthalocyaninbaseret kromofor, der binder til lipid på plasmamembranen og internaliseres gennem endocytose og til sidst akkumuleres i lysosomet gennem den endocytiske vej¹⁸. Det absorberer lys i et nær-infrarødt spektralområde og genererer singlet oxygen, en vigtig ROS genereret af exciteret AlPcS_2a¹⁸. Singlet oxygen, der henfalder hurtigt, begrænser dets diffusions- og reaktionsafstand inden for et lille område i celler (ca. 10-20 nm)¹⁹. Ved at justere varigheden af AlPcS_{2a-inkubation} og lysbelysning er rumlig tidsmæssig kontrol af beskadigelsen af IV’er inden for et subcellulært område tilladt. CALI bliver derfor et kraftfuldt værktøj til at undersøge konsekvenserne af IV-skader og dannelsen og reguleringen af IV’er.

I denne undersøgelse behandles en specifik protokol for CALI, der bruger AlPcS_2a som fotosensibilisator. Denne protokol kan anvendes på forskellige typer IV’er, herunder endosomer og lysosomer, og bruges til at undersøge opfølgningsresponserne efter membranbrud. HeLa-celler, der udtrykker fluorofor-konjugeret galectin-3^16,20 afsløret efter lysosombrud^, bruges til at demonstrere denne protokol.

Protocol

1. Forberedelse af AlPcS2a-lager 10 mg AlPcS2a opløses i 400 μL 0,1 M NaOH. For at forbedre opløseligheden opvarmes opløsningen til 50 °C og hvirvelstrøm. Bland opløsningen med 4 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Derefter filtreres opløsningen med et 0,22 μm filter for at fjerne de uopløselige bundfald. Opløsningens koncentration måles gennem et UV-Vis-spektrofotometer. Udryddelseskoefficienten for AlPcS2a ved 672 nm er 4 x 104…

Representative Results

En skematisk figur, der repræsenterer AlPcS2a-induceret skade på IV, herunder endosom og lysosom, er vist (figur 1). Kommercielt tilgængelige markører kan bruges til at bestemme AlPcS2a-farvningsbetingelserne. For eksempel AlPcS 2a puncta og grønt fluorescerende farvestof22 colokalisering (figur 2). Fluoroformærket galectin-3 kan anvendes som in…

Discussion

AlPcS_2a binder til plasmamembranen, internaliseres derefter ved endocytose og akkumuleres til sidst i lysosomer. AlPcS_2a kan således lokaliseres i de subcellulære rum ved at justere inkubationsvarigheden. En begrænsning af denne metode er, at kun en underpopulation af IV’er kunne mærkes af AlPcS_2a gennem endocytose, fordi der er mange andre membrankilder til IV’er, såsom ER- og Golgi-apparater. Derudover ville den selektive mærkning af AlPcS_2a i tidlige eller sene endosom…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1