Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine
Summary
Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un’analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l’applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l’ambiente fisiologico in vivo .
Abstract
La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall’utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un’impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.
Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.
Introduction
Nell’ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all’uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci 1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci 4,5,6. L’uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei risultati. La coltivazione 3D a lungo termine di tessuti miocardici con geometria intatta, tuttavia, non è ben consolidata. La geometria intatta è una caratteristica chiave per imitare le condizioni in vivo, poiché la corretta funzione cardiaca, la comunicazione tra cellule diverse e le interazioni cellula-matrice sono prerequisiti. La coltivazione del tessuto miocardico ha attraversato varie fasi di sviluppo. Il tasso di successo e la stabilità della coltivazione di tessuti miocardici ex vivo erano inizialmente piuttosto bassi, ma gli approcci recenti hanno prodotto risultati promettenti 7,8,9,10,11.
Tra questi, Fischer et al. sono stati i primi a dimostrare che la vitalità e le prestazioni contrattili del tessuto miocardico umano possono essere mantenute nella coltivazione cellulare ex vivo per molte settimane7. La loro tecnica si basava su sottili fette di tessuto tagliate dal miocardio umano espiantato, che erano montate in camere di coltivazione di nuova concezione che fornivano condizioni biomeccaniche definite e stimolazione elettrica continua. Questo metodo di coltivazione assomiglia molto alla funzione in vivo del tessuto miocardico ed è stato riprodotto da diversi gruppi di ricerca indipendenti 2,12,13,14,15. È importante sottolineare che le camere utilizzate da Fischer et al. hanno anche permesso la registrazione continua delle forze sviluppate per un massimo di 4 mesi, aprendo così opportunità senza precedenti per la ricerca fisiologica e farmacologica sul miocardio umano intatto7.
Tecniche simili sono state sviluppate indipendentemente da altri gruppi e applicate al miocardio umano, di ratto, suino e di coniglio 7,10,11. Pitoulis et al. hanno successivamente sviluppato un metodo più fisiologico, che riproduce la normale relazione forza-lunghezza durante un ciclo di contrazione, ma è meno adatto per l’analisi ad alto rendimento16. In quanto tale, l’approccio generale della coltivazione biomimetica può essere considerato come un ulteriore passo verso la riduzione, l’affinamento e la sostituzione (3R) degli esperimenti sugli animali.
Tuttavia, lo sfruttamento di questo potenziale richiede procedure standardizzate, analisi ad alto contenuto e un elevato livello di throughput. Presentiamo una tecnica che combina l’affettamento automatizzato del miocardio umano vivente con il mantenimento in vitro in un sistema di coltivazione biomimetico che è diventato disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Con l’approccio proposto, il numero di singole fette che possono essere generate da un singolo campione miocardico transmurale è limitato solo dal tempo di elaborazione. Un campione di dimensioni e qualità sufficienti (3 cm x 3 cm) produce spesso 20-40 fette di tessuto che vengono comodamente tagliate con un vibratoma automatizzato. Queste fette possono essere collocate in camere di coltivazione appartenenti al sistema. Le camere consentono la stimolazione elettrica, i cui parametri possono essere modulati (cioè durata dell’impulso, polarità, velocità e corrente), nonché la regolazione del pre- e postcarico, utilizzando fili a molla all’interno delle camere. La contrazione di ogni fetta è registrata dal movimento di un piccolo magnete attaccato a un filo a molla e visualizzato come un grafico interpretabile. I dati possono essere registrati in ogni momento e analizzati utilizzando un software disponibile gratuitamente. Oltre alla stimolazione costante al basale, è possibile eseguire protocolli programmati per valutare funzionalmente il loro periodo refrattario, la soglia di stimolazione, il potenziamento post-pausa e la relazione forza-frequenza.
Questa coltivazione biomimetica a lungo termine di più fette miocardiche da un singolo cuore apre la strada a future ricerche ex vivo sia nel tessuto umano che in quello animale e facilita lo screening per gli effetti terapeutici e cardiotossici dei farmaci nella medicina cardiovascolare. È già stato applicato a vari approcci sperimentali 2,12,13,15. Qui, forniamo una descrizione dettagliata passo-passo della preparazione del tessuto umano e forniamo soluzioni per i problemi di coltivazione frequentemente incontrati.
Protocol
Representative Results
Discussion
In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all’ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l’applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch per il loro supporto nella preparazione degli allestimenti, nonché per il regolare mantenimento della coltivazione dei tessuti.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Referências
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