Fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) tramite tecnologia microfluidica

Summary

Il presente protocollo descrive la fabbricazione di microsfere porose altamente aperte (HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) attraverso la tecnologia microfluidica facile basata sulla formulazione a singola emulsione. Queste microsfere hanno potenziali applicazioni nell’ingegneria tissutale e nello screening dei farmaci.

Abstract

Rispetto agli scaffold di massa e all’iniezione diretta di cellule da sole, le unità modulari iniettabili hanno raccolto un enorme interesse nella riparazione dei tessuti malfunzionanti grazie alla praticità nel confezionamento delle cellule, al miglioramento della ritenzione cellulare e alla minima invasività. Inoltre, la conformazione porosa di questi vettori su microscala potrebbe migliorare lo scambio del mezzo e migliorare il livello di nutrienti e forniture di ossigeno. Il presente studio illustra la fabbricazione conveniente di microsfere porose altamente aperte (PLGA-HOPM) a base di acido poli(lattico-co-glicolico) mediante la facile tecnologia microfluidica per applicazioni di rilascio cellulare. I PLGA-HOPM monodispersi risultanti possedevano dimensioni delle particelle di ~400 μm e pori aperti di ~50 μm con finestre interconnesse. In breve, le goccioline di olio emulsionato (soluzione PLGA in diclorometano, DCM), avvolte con la fase acquosa di gelatina al 7,5% (p/v), sono state introdotte nella soluzione acquosa a flusso continuo di poli(alcool vinilico) (PVA) all’1% (p/v) attraverso l’ugello coassiale nella configurazione microfluidica personalizzata. Successivamente, le microsfere sono state sottoposte a procedure di estrazione con solvente e liofilizzazione, con conseguente produzione di HOPM. In particolare, varie formulazioni (concentrazioni di PLGA e porogeno) e parametri di lavorazione (potenza emulsionante, agometro e portata della fase dispersa) svolgono un ruolo cruciale nelle qualità e nelle caratteristiche dei HOPM PLGA risultanti. Inoltre, queste architetture potrebbero potenzialmente incapsulare vari altri segnali biochimici, come i fattori di crescita, per la scoperta di farmaci estesi e applicazioni di rigenerazione dei tessuti.

Introduction

Le microsfere cariche di cellule offrono vantaggi favorevoli, come una maggiore capacità di ritenzione cellulare in situ, una consegna efficiente delle cellule e la successiva capacità di proliferazione cellulare in vivo¹. Ad oggi, sono state avanzate numerose indagini per lo sviluppo di una struttura di impalcatura di successo per supportare un ambiente favorevole per le cellule per la rigenerazione dei tessuti o applicazioni di screening farmacologico². Tuttavia, l’ambiente di ipossia è spesso inevitabile negli interni a causa di insufficienti forniture di nutrienti / ossigeno e accumulo di rifiuti metabolici³. Per ovviare a questi problemi, sono state sviluppate microsfere altamente porose (PM) utilizzando vari biomateriali ^4,5,6. Inoltre, nella coltura dinamica, gli scaffold soffrono di eccessivo sforzo di taglio⁷ e lo stato instabile del terreno di coltura potrebbe rompere la fedeltà dei PM. In alternativa, il poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA) potrebbe essere utilizzato per trattare PM con buona resistenza meccanica per coltura dinamica¹. Ad esempio, abbiamo dimostrato la co-iniezione di PMs altamente aperti (HOPM) PLGA carichi di mioblasti di topo (C2C12) e microrod cavi carichi di poli(glicole etilenico) carichi di poli(glicole etilenico) di topo per guarire la perdita muscolare volumetrica, ottenendo un notevole miglioramento della rigenerazione del muscolo scheletrico in situ ⁸.

In particolare, i PM sono caratterizzati da ampie aree superficiali e da elevate porosità, che è di interesse specifico per l’adesione cellulare e la crescita verso la consegna cellulare minimamente invasiva⁹. In considerazione di questi aspetti, sono stati impiegati vari materiali biocompatibili per fabbricare i PM^10,11. Questi PM progettabili in cocoltura con cellule offrono un’adesione eccellente, una notevole resistenza meccanica e finestre altamente interconnesse, che potrebbero migliorare la proliferazione cellulare per riparare i tessuti danneggiati¹². A questo proposito, sono state sviluppate anche varie tecnologie per fabbricare sfere porose^13,14. Da un lato, i PM sono stati prodotti utilizzando agenti che formano gas, come NH₄HCO₃, che sono stati trattenuti a causa dell’insufficiente interconnettività^15,16,17. D’altra parte, i PM sono stati direttamente tranciati dopo l’emulsione, il che ha portato a PM polidispersi¹⁸. Alla fine, la tecnologia microfluidica a goccia basata sull’approccio del modello di emulsione è forse un metodo efficiente per costruire PM, poiché spesso si traduce in particelle di dimensioni uniformi¹⁹. In particolare, gli attributi morfologici delle microsfere spesso dipendono dalla qualità delle goccioline di emulsione generate (cioè acqua-in-olio, W/O, o olio-in-acqua, O/W), che possono influenzare significativamente gli attributi dei biomateriali²⁰. Vale la pena notare che la piattaforma microfluidica preprogettata può essere applicata per generare le microfibre o le microsfere. In un esempio, Yu et al. hanno dimostrato la produzione di strutture microfibrose cariche di cellule basate su piattaforme microfluidiche capillari, che potrebbero essere utilizzate per assemblare reti cellulari per imitare i tessuti naturali²¹. In un altro caso, Ye et al. hanno fabbricato microcapsule di cristalli fotonici mediante la replicazione modello di perle di cristallo colloidale di silice attraverso tecnologie microfluidiche, che potrebbero superare molti limiti delle attuali tecniche che richiedono un’etichettatura complessa e un apparato specifico²².

In effetti, la logica alla base dell’utilizzo di questa tecnica è dovuta a vari vantaggi, come la sua natura facile, che non richiede attrezzature sofisticate e la sua convenienza nel sintetizzare PM di dimensioni uniformi per la consegna di cellule e applicazioni di medicina rigenerativa. In questo contesto, con componenti predefiniti di emulsione-templating, i PM con elevate porosità e interconnettività possono essere comodamente ottenuti da un dispositivo microfluidico assemblato da tubi di poli(cloruro di vinile) (PVC), un capillare di vetro e un ago. Un precursore di emulsione W/O viene preparato omogeneizzando una soluzione acquosa di gelatina e una soluzione organica di PLGA. Iniettando selettivamente la porzione applicabile dell’emulsione nella piattaforma microfluidica, vengono fabbricati i PM con dimensioni uniformi delle particelle e pori interconnessi attraverso la superficie fino all’interno. Il presente protocollo mira a fabbricare i PLGA-HOPM mediante emulsione-templating nella piattaforma microfluidica. Si ritiene che questo protocollo consenta la produzione riproducibile di PLGA-HOPM e sarà potenzialmente applicabile nei loro campi correlati di ingegneria tissutale e screening farmacologico.

Protocol

1. Preparazione delle soluzioni Preparare preventivamente la soluzione madre di PVA riscaldandola a bagnomaria a 80 °C e successivamente mettendola in frigorifero a 4 °C. Raffreddare a temperatura ambiente (RT) per uso sperimentale. Preparare il precursore dell’emulsione aggiungendo la soluzione acquosa di gelatina (1 mL, 7,5%, p/v) alla fase organica di PLGA (2 mL, 2%, p/v in diclorometano, DCM) (vedere Tabella dei materiali).NOTA: Generalmente, la tecnologia …

Representative Results

Sulla base di lavori precedenti che hanno ottimizzato i parametri principali1, il PLGA è stato sciolto nel solvente DCM evaporabile. L’emulsione primaria W/O è stata preparata mediante omogeneizzazione con gelatina sotto trattamento con sonda ad ultrasuoni. La struttura fluidica co-flow personalizzata è stata assemblata in modo semplicistico, in cui è stata impiegata una siringa per introdurre costantemente i flussi. Inoltre, sono state eseguite sufficienti procedure di risciacquo per eliminar…

Discussion

Questo articolo descrive una strategia efficiente per fabbricare architetture basate su PLGA, vale a dire i PLGA-OPM. Va notato che diversi passaggi critici devono essere presi con attenzione, tra cui evitare la volatilizzazione del solvente del PLGA e regolare delicatamente la potenza ultrasonica nella posizione target durante la preparazione dell’emulsione. Inoltre, l’uscita del liquido della siringa da 20 mL può essere regolata in una certa misura per risolvere la separazione di fase dei precursori emulsionati. Tutta…

Materials

Centrifuge tube	Solarbio, Beijing, China		5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy	Leica, Wetzlar, Germany		TCS SP8
Dichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Research Grade
Dispensing needle	Kindly, Shanghai, China		26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Research Grade
Freeze drier	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatin	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# SZBF2870V	From porcine skin, Type A
Glass bottom plate	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary	Huaou, Jiangsu, China		0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit	Solarbio, Beijing, China	60421211112	Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S
Microflow injection pump	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra	2135250	Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCF9651	66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	lot# MKCK4266	13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube	Shenchen, Shanghai, China		Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells	Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope	Phenom pure, Eindhoven, Netherlands		Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose	Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformer	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV curing glue	Zhuolide, Foshan, China		D-3100