एफएसीएस-अलगाव और फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों और मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति अनियंत्रित और घायल माउस कंकाल की मांसपेशी से
Summary
फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज कोशिकाओं (एफएपी) और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की सटीक पहचान शारीरिक और रोग स्थितियों में उनके जैविक कार्य का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल वयस्क माउस मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी के अलगाव, शुद्धिकरण और संस्कृति के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।
Abstract
फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज कोशिकाएं (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी-निवासी मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) की आबादी हैं जो फाइब्रोजेनिक, एडिपोजेनिक, ओस्टियोजेनिक या चोंड्रोजेनिक वंश के साथ अंतर करने में सक्षम हैं। मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) के साथ, एफएपी मांसपेशी होमियोस्टेसिस, मरम्मत और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जबकि बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को सक्रिय रूप से बनाए रखते हैं और फिर से तैयार करते हैं। पैथोलॉजिकल स्थितियों में, जैसे कि पुरानी क्षति और मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी, एफएपी विपथन सक्रियण से गुजरते हैं और कोलेजन-उत्पादक फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जिससे फाइब्रोसिस और इंट्रामस्क्युलर फैटी घुसपैठ होती है। इस प्रकार, एफएपी मांसपेशियों के उत्थान में दोहरी भूमिका निभाते हैं, या तो एमयूएससी टर्नओवर को बनाए रखने और ऊतक की मरम्मत को बढ़ावा देने या फाइब्रोटिक निशान गठन और एक्टोपिक वसा घुसपैठ में योगदान करके, जो कंकाल की मांसपेशी ऊतक की अखंडता और कार्य से समझौता करते हैं। शारीरिक और पैथोलॉजिकल स्थितियों में इन कोशिकाओं की जैविक भूमिका को समझने के लिए एफएपी और एमयूएससी का उचित शुद्धिकरण एक शर्त है। यहां, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके वयस्क चूहों के अंग की मांसपेशियों से एफएपी और एमयूएससी के एक साथ अलगाव के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल पूरे अंग की मांसपेशियों और घायल टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों से मोनोन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं के यांत्रिक और एंजाइमी पृथक्करण का विस्तार से वर्णन करता है। एफएपी और एमयूएससी को बाद में शुद्ध सेल आबादी प्राप्त करने के लिए अर्ध-स्वचालित सेल सॉर्टर का उपयोग करके अलग किया जाता है। हम इसके अतिरिक्त अकेले या सहसंस्कृति स्थितियों में शांत और सक्रिय एफएपी और एमयूएससी की खेती के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी शरीर में सबसे बड़ा ऊतक है, वयस्क मानव वजन के ~ 40% के लिए लेखांकन, और मुद्रा बनाए रखने, आंदोलन पैदा करने, बेसल ऊर्जा चयापचय को विनियमित करने और शरीर के तापमान के लिए जिम्मेदार है1. कंकाल की मांसपेशी एक अत्यधिक गतिशील ऊतक है और इसमें विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं के अनुकूल होने की उल्लेखनीय क्षमता होती है, जैसे कि यांत्रिक तनाव, चयापचय परिवर्तन और दैनिक पर्यावरणीय कारक। इसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी तीव्र चोट के जवाब में पुनर्जीवित होती है, जिससे इसकी आकृति विज्ञान और कार्यों की पूरी बहालीहोती है 2. कंकाल की मांसपेशी प्लास्टिसिटी मुख्य रूप से निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की आबादी पर निर्भर करती है, जिसे उपग्रह कोशिकाएं भी कहा जाता है, जो मायोफाइबर प्लाज्मा झिल्ली और बेसल लामिना 2,3 के बीच स्थित हैं। सामान्य परिस्थितियों में, एमयूएससी सेलुलर टर्नओवर की भरपाई करने और स्टेम सेल पूल4 को फिर से भरने के लिए केवल कुछ डिवीजनों के साथ, एक शांत अवस्था में मांसपेशियों के आला में रहते हैं। चोट के जवाब में, एमयूएससी कोशिका चक्र में प्रवेश करते हैं, प्रसार करते हैं, और या तो नए मांसपेशी फाइबर के गठन में योगदान करते हैं या आत्म-नवीकरण प्रक्रिया 2,3 में आला पर लौटते हैं। एमयूएससी के अलावा, कंकाल की मांसपेशियों का होमोस्टैटिक रखरखाव और उत्थान फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों (एफएपी) 5,6,7 नामक मांसपेशी निवासी कोशिकाओं की आबादी के समर्थन पर निर्भर करता है। एफएपी मांसपेशियों के संयोजी ऊतक में एम्बेडेड मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं और फाइब्रोजेनिक, एडिपोजेनिक, ओस्टियोजेनिक, या चोंड्रोजेनिक वंश 5,8,9,10 के साथ अंतर करने में सक्षम हैं। एफएपी एमयूएससी के लिए संरचनात्मक सहायता प्रदान करते हैं क्योंकि वे मांसपेशी स्टेम सेल आला में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का स्रोत हैं। एफएपी साइटोकिन्स और विकास कारकों को स्रावित करके कंकाल की मांसपेशियों के दीर्घकालिक रखरखाव को भी बढ़ावा देते हैं जो मायोजेनेसिस और मांसपेशियों की वृद्धि 6,11 के लिए ट्रॉफिक समर्थन प्रदान करते हैं। तीव्र मांसपेशियों की चोट पर, एफएपी तेजी से एक क्षणिक आला का उत्पादन करने के लिए फैलता है जो पुनर्जन्म मांसपेशियों की संरचनात्मक अखंडता का समर्थन करता है और एमयूएससी प्रसार और भेदभाव को पैराक्राइन तरीके से बनाए रखने के लिए एक अनुकूल वातावरण प्रदान करताहै 5. जैसे-जैसे उत्थान आगे बढ़ता है, एफएपी को एपोप्टोसिस द्वारा पुनर्योजी मांसपेशियों से साफ कर दिया जाता है, और उनकी संख्या धीरे-धीरे बेसल स्तर12 पर वापस आ जाती है। हालांकि, पुरानी मांसपेशियों की चोट के पक्ष में स्थितियों में, एफएपी प्रो-एपोप्टोटिक सिग्नलिंग को ओवरराइड करते हैं और मांसपेशियों के आला में जमा होते हैं, जहां वे कोलेजन-उत्पादक फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जिससे एक्टोपिक वसा घुसपैठ और फाइब्रोटिक निशान गठन12,13 होता है।
उनकी मल्टीपोटेंसी और उनकी पुनर्योजी क्षमताओं के कारण, एफएपी और एमयूएससी को कंकाल की मांसपेशी विकारों के उपचार के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित लक्ष्यों के रूप में पहचाना गया है। इसलिए, उनके कार्य और चिकित्सीय क्षमता की जांच करने के लिए, एफएपी और एमयूएससी के अलगाव और संस्कृति के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करना महत्वपूर्ण है।
प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) आकार और दानेदारता जैसी रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर विभिन्न सेल आबादी की पहचान कर सकता है, और सेल सतह मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के उपयोग के आधार पर सेल-विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है। वयस्क चूहों में, एमयूएससी संवहनी कोशिका आसंजन अणु 1 (वीसीएएम -1, जिसे सीडी 106 के रूप में भी जाना जाता है) 14,15 और α7-इंटीग्रिन15 को व्यक्त करते हैं, जबकि एफएपी प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर α (पीडीजीएफआर) और स्टेम सेल एंटीजन 1 (एससीए 1 या लाइ 6 ए / . यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, एमयूएससी की पहचान सीडी 31-/सीडी45-/एससीए1-/वीसीएएम-1+/α7-इंटीग्रिन+ के रूप में की गई थी, जबकि एफएपी की पहचान सीडी31-/सीडी45-/एससीए1+/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन-के रूप में की गई थी। वैकल्पिक रूप से, पीडीजीएफआरयूईजीएफपी चूहों को एफएपी को सीडी 31-/सीडी45-/पीडीजीएफआरयू +/वीसीएएम-1-/α7-इंटीग्रिन- घटनाओं18,19 के रूप में अलग करने के लिए नियोजित किया गया था। इसके अलावा, हमने पीडीजीएफआर-जीएफपी + कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट सिग्नल के बीच ओवरलैपिंग की तुलना सतह मार्कर एससीए 1 द्वारा पहचानी गई कोशिकाओं से की। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि सभी जीएफपी-व्यक्त कोशिकाएं एससीए 1 के लिए भी सकारात्मक थीं, यह दर्शाता है कि एफएपी की पहचान और अलगाव के लिए या तो दृष्टिकोण नियोजित किया जा सकता है। अंत में, विशिष्ट मार्कर एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्रत्येक सेल आबादी की शुद्धता की पुष्टि की।
Protocol
Representative Results
Discussion
शुद्ध वयस्क स्टेम सेल आबादी की पहचान और अलगाव के लिए कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल स्थापित करना उनके कार्य को समझने की दिशा में पहला और सबसे महत्वपूर्ण कदम है। पृथक एफएपी और एमयूएसस?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एमयूएससी अलगाव पर सलाह के लिए टॉम चेउंग (हांगकांग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को एनआईएच अनुदान एआर 041126 और एआर 041164 के माध्यम से एनआईएएमएस-आईआरपी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referências
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