تصنيع وتوصيف مصفوفة نانو قاعدة جانوس طبقة تلو الأخرى لتعزيز تجديد الغضروف
Summary
يصف هذا البروتوكول تجميع سقالة مصفوفة نانو قاعدة جانوس (JBNm) طبقة تلو الأخرى عن طريق إضافة أنابيب جانوس النانوية الأساسية (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-β1) بالتتابع. تم تصنيع JBNm وتمييزه. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر نشاطا حيويا ممتازا ، مما شجع وظائف الخلايا مثل الالتصاق والانتشار والتمايز.
Abstract
تم تطوير سقالات مختلفة من المواد الحيوية لتوجيه التصاق الخلايا وانتشارها على أمل تعزيز وظائف محددة للاستخدامات في المختبر وفي الجسم الحي . تتم إضافة عوامل النمو إلى سقالات المواد الحيوية هذه بشكل عام لتوفير بيئة مثالية لزراعة الخلايا ، ووساطة تمايز الخلايا ووظائفها اللاحقة. ومع ذلك ، فإن عوامل النمو في سقالة المواد الحيوية التقليدية عادة ما يتم تصميمها ليتم إطلاقها عند الزرع ، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية غير مقصودة على الأنسجة أو الخلايا المحيطة. هنا ، نجحت مصفوفة النانو الأساسية المستوحاة من الحمض النووي Janus (JBNm) في تحقيق بيئة مجهرية محلية للغاية مع بنية طبقة تلو الأخرى لهياكل أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا. يتم تجميع JBNms ذاتيا من الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو beta-1 (TGF-β1) عبر التقارب الحيوي. تم تجميع JBNm بنسبة TGF-β1:matrilin-3:JBNt من 1:4:10 ، حيث كانت هذه هي النسبة المحددة التي يمكن أن يحدث فيها التجميع المناسب في بنية طبقة تلو الأخرى. أولا ، تمت إضافة حل TGF-β1 إلى حل matrilin-3. بعد ذلك ، تم ماصة هذا الخليط عدة مرات لضمان التجانس الكافي قبل إضافة محلول JBNt. شكل هذا JBNm طبقة تلو الأخرى ، بعد السحب عدة مرات مرة أخرى. تم إجراء مجموعة متنوعة من التجارب لتوصيف بنية JBNm طبقة تلو الأخرى ، JBNts وحدها ، matrilin-3 وحدها ، و TGF-β1 وحدها. تمت دراسة تكوين JBNm باستخدام أطياف امتصاص UV-Vis ، ولوحظ هيكل JBNm باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). نظرا لأن سقالة JBNm المبتكرة طبقة تلو الأخرى تتشكل على نطاق جزيئي ، يمكن ملاحظة JBNm المسمى بصبغة الفلورسنت. يقتصر TGF-β1 داخل الطبقة الداخلية من JBNm القابل للحقن ، والذي يمكن أن يمنع إطلاق عوامل النمو إلى المناطق المحيطة ، ويعزز تكوين الغضروف الموضعي ، ويعزز بيئة دقيقة مضادة للضخامة.
Introduction
تلعب السقالات في هندسة الأنسجة دورا حيويا في توفير الدعم الهيكلي لربط الخلايا وتطوير الأنسجة اللاحق1. عادة ، تعتمد هياكل الأنسجة التقليدية دون أي سقالات على بيئة زراعة الخلايا وعوامل النمو المضافة للتوسط في تمايز الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن هذه الإضافة للجزيئات النشطة بيولوجيا إلى السقالات غالبا ما تكون النهج المفضل في توجيه تمايز الخلايا ووظيفتها 2,3. يمكن لبعض السقالات محاكاة البيئة الدقيقة الكيميائية الحيوية للأنسجة الأصلية بشكل مستقل ، في حين أن البعض الآخر يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على وظائف الخلايا عبر عوامل النمو. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الباحثون تحديات في اختيار السقالات التي يمكن أن تؤثر بشكل إيجابي على التصاق الخلايا ونموها وتمايزها ، مع توفير الدعم الهيكلي الأمثل والاستقرار على مدى فترة طويلة 4,5. غالبا ما ترتبط الجزيئات النشطة بيولوجيا بشكل فضفاض بالسقالة مما يؤدي إلى إطلاق سريع لهذه البروتينات عند الزرع ، مما يؤدي إلى إطلاقها في مواقع غير مرغوب فيها. هذا يبلغ ذروته في الآثار الجانبية على الأنسجة أو الخلايا التي لم يتم استهدافها عمدا 6,7.
عادة ما تكون السقالات مصنوعة من مواد بوليمرية. مصفوفة النانو الأساسية Janus (JBNm) هي منصة سقالة محاكاة حيوية تم إنشاؤها باستخدام طريقة جديدة طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا8. وقد سميت هذه الأنابيب النانوية الجديدة المستوحاة من الحمض النووي باسم الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، لأنها تحاكي بشكل صحيح بنية وكيمياء سطح الكولاجين الموجودة في المصفوفة خارج الخلية (ECM). مع إضافة جزيئات نشطة بيولوجيا ، مثل matrilin-3 وتحويل عامل النمو Beta-1 (TGF-β1) ، يمكن ل JBNm إنشاء بيئة دقيقة مثالية يمكنها بعد ذلك تحفيز وظائف الخلايا والأنسجة المطلوبة9.
JBNts هي أنابيب نانوية جديدة مشتقة من إصدارات اصطناعية من الأدينين والثيمين. يتم تشكيل JBNts من خلال التجميع الذاتي10 ؛ ترتبط ست قواعد نووية اصطناعية لتشكيل حلقة ، وتخضع هذه الحلقات لتفاعلات تكديس π π لإنشاء أنبوب نانوي بطول 200-300 ميكرومتر11. هذه الأنابيب النانوية تشبه هيكليا بروتينات الكولاجين. من خلال محاكاة جانب من البيئة الدقيقة للغضروف الأصلي ، ثبت أن JBNts يوفر موقعا مواتيا للخلايا الغضروفية والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) 11،12،13،14. نظرا لأن الأنابيب النانوية تخضع للتجميع الذاتي ولا تتطلب أي نوع من البادئ (مثل الأشعة فوق البنفسجية) ، فإنها تظهر إمكانات مثيرة كسقالة قابلة للحقن لمناطق العيوب التي يصعب الوصول إليها15.
Matrilin-3 هو بروتين مصفوفة هيكلي خارج الخلية موجود في الغضروف. يلعب هذا البروتين دورا مهما في تكوين الغضروف ووظيفة الغضروف المناسبة16,17. في الآونة الأخيرة ، تم تضمينه في سقالات المواد الحيوية ، مما شجع على تكوين الغضروف دون تضخم9،18،19. من خلال تضمين هذا البروتين في JBNm ، تنجذب خلايا الغضروف إلى سقالة تحتوي على مكونات مماثلة لتلك الموجودة في بيئتها الدقيقة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن هناك حاجة إلى matrilin-3 لإشارات TGF-β1 المناسبة داخل الخلايا الغضروفية20. تعمل عوامل النمو كجزيئات إشارة ، مما يسبب نموا محددا لخلية أو نسيج معين. وبالتالي ، لتحقيق التجديد الأمثل للغضروف ، فإن matrilin-3 و TGF-β1 هي مكونات أساسية داخل JBNm. يمكن أن تؤدي إضافة TGF-β1 إلى السقالة طبقة تلو الأخرى إلى زيادة تعزيز تجديد الغضروف في بناء الأنسجة. TGF-β1 هو عامل نمو يستخدم لتشجيع عملية الشفاء من العيوب العظمية الغضروفية ، وتشجيع انتشار الخلايا الغضروفية و hMSC والتمايز21,22. وبالتالي ، يلعب TGF-β1 دورا رئيسيا في تجديد الغضروف JBNm (J / T / M JBNm)23 ، مما يشجع على النمو السليم خاصة عندما يتم توطينه داخل طبقات JBNm.
كما ذكرنا سابقا ، يتم تجميع عوامل النمو عادة على السطح الخارجي للسقالات دون طرق محددة للدمج. هنا ، مع البنية النانوية المصممة بدقة للمواد الحيوية ، تم تطوير JBNm لاستهداف محدد للخلايا والأنسجة المقصودة. يتكون JBNm من TGF-β1 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الداخلية و matrilin-3 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الخارجية24,25. يسمح دمج TGF-β1 في الطبقة الداخلية لهيكل الطبقة تلو الأخرى ببيئة دقيقة موضعية للغاية على طول ألياف JBNm ، مما يخلق بنية أنسجة استتبابية مع إطلاق أبطأ بكثير للبروتين12. إن قابلية حقن JBNm تجعله بنية مثالية لأنسجة الغضروف لمختلف تطبيقات المواد الحيوية المستقبلية26.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من هذه الدراسة هو تطوير منصة سقالة محاكاة حيوية ، JBNm ، للتغلب على قيود هياكل الأنسجة التقليدية التي تعتمد على بيئات زراعة الخلايا للتوسط في تمايز الخلايا. JBNm عبارة عن سقالة بنية طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة غضروفية مستدامة ذاتيا. ويستند التصميم المبتكر إلى مواد نانوية جديدة مستوحاة م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 7R01AR072027 و 7R03AR069383 ، وجائزة NSF المهنية 1905785 ، و NSF 2025362 ، وجامعة كونيتيكت. يتم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD016435.
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
Referências
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
- Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
- Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
- James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
- Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
- Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
- Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
- Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
- Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
- Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
- Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
- Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
- Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
- Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
- Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
- Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
- Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
- Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
- Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
- Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
- Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
- Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
- Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
- Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
- Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
- Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
- Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
- Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
- Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
- Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).
