Fremstilling og karakterisering af lag-for-lag Janus base nano-matrix for at fremme bruskregenerering

Summary

Denne protokol beskriver samlingen af et lag for lag Janus base nano-matrix (JBNm) stillads ved at tilføje Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekventielt. JBNm blev fabrikeret og karakteriseret; Derudover viste den fremragende bioaktivitet og tilskyndede cellefunktioner såsom vedhæftning, spredning og differentiering.

Abstract

Forskellige biomateriale stilladser er blevet udviklet til at styre celleadhæsion og spredning i håb om at fremme specifikke funktioner til in vitro og in vivo anvendelser. Tilsætningen af vækstfaktorer i disse biomaterialestilladser udføres generelt for at give et optimalt cellekulturmiljø, medierende celledifferentiering og dets efterfølgende funktioner. Imidlertid er vækstfaktorerne i et konventionelt biomaterialestillads typisk designet til at blive frigivet ved implantation, hvilket kan resultere i utilsigtede bivirkninger på omgivende væv eller celler. Her har den DNA-inspirerede Janus base nano-matrix (JBNm) med succes opnået et meget lokaliseret mikromiljø med en lag-for-lag struktur til selvbærende bruskvævskonstruktioner. JBNms er selvsamlet fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm blev samlet i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har været det bestemte forhold, hvor korrekt samling i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først blev TGF-β1-opløsningen tilsat til matrilin-3-opløsningen. Derefter blev denne blanding pipetteret flere gange for at sikre tilstrækkelig homogenitet før tilsætningen af JBNt-opløsningen. Dette dannede lag for lag JBNm efter pipettering flere gange igen. En række eksperimenter blev udført for at karakterisere JBNm-strukturen lag for lag, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen af JBNm blev undersøgt med UV-Vis absorptionsspektre, og strukturen af JBNm blev observeret med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Da det innovative JBNm-stillads lag for lag dannes i molekylær skala, kunne det fluorescerende farvestofmærkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrænset inden for det indre lag af den injicerbare JBNm, som kan forhindre frigivelse af vækstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokaliseret chondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Introduction

Stilladser inden for vævsteknik spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til cellebinding og efterfølgende vævsudvikling¹. Typisk er konventionelle vævskonstruktioner uden stilladser afhængige af cellekulturmiljøet og tilføjede vækstfaktorer for at formidle celledifferentiering. Desuden er denne tilsætning af bioaktive molekyler til stilladser ofte den foretrukne tilgang til styring af celledifferentiering og funktion ^2,3. Nogle stilladser kan efterligne det biokemiske mikromiljø af naturligt væv uafhængigt, mens andre direkte kan påvirke cellefunktioner via vækstfaktorer. Forskere støder dog ofte på udfordringer med at vælge stilladser, der kan påvirke celleadhæsion, vækst og differentiering positivt, samtidig med at de giver optimal strukturel støtte og stabilitet over en lang periode ^4,5. De bioaktive molekyler er ofte løst bundet til stilladset, hvilket fører til hurtig frigivelse af disse proteiner ved implantation, hvilket resulterer i deres frigivelse på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på væv eller celler, der ikke bevidst blev målrettet ^6,7.

Stilladser er typisk lavet af polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stilladsplatform skabt med en ny lag-for-lag metode til selvbærende bruskvævskonstruktion⁸. Disse nye DNA-inspirerede nanorør er blevet navngivet Janus base nanorør (JBNts), da de korrekt efterligner strukturen og overfladekemien af kollagen, der findes i den ekstracellulære matrix (ECM). Med tilføjelsen af bioaktive molekyler, såsom matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skabe et optimalt mikromiljø, som derefter kan stimulere ønsket celle- og vævsfunktionalitet⁹.

JBNts er nye nanorør afledt af syntetiske versioner af nukleobase-adenin og thymin. JBNts dannes gennem selvmontering¹⁰; Seks syntetiske nukleobaser binder sig til dannelse af en ring, og disse ringe gennemgår π-π stablingsinteraktioner for at skabe et nanorør 200-300 μm i længde¹¹. Disse nanorør ligner strukturelt kollagenproteiner; ved at efterligne et aspekt af det indfødte bruskmikromiljø har JBNts vist sig at give et gunstigt fastgørelsessted for chondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSC’er)^11,12,13,14. Fordi nanorørene gennemgår selvmontering og ikke kræver nogen form for initiator (såsom UV-lys), viser de spændende potentiale som et injicerbart stillads til svært tilgængelige defektområder¹⁵.

Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matrixprotein, der findes i brusk. Dette protein spiller en væsentlig rolle i chondrogenese og korrekt bruskfunktion^16,17. For nylig er det blevet inkluderet i biomateriale stilladser, der tilskynder til chondrogenese uden hypertrofi 9,18,19. Ved at inkludere dette protein i JBNm tiltrækkes bruskceller til et stillads, der indeholder lignende komponenter som dets oprindelige mikromiljø. Derudover har det vist sig, at matrilin-3 er nødvendig for korrekt TGF-β1-signalering inden for kondrocytter²⁰. Vækstfaktorer fungerer som signalmolekyler, der forårsager specifik vækst af en bestemt celle eller væv. For at opnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 væsentlige komponenter inden for JBNm. Tilsætningen af TGF-β1 i stilladset lag for lag kan yderligere fremme bruskregenerering i en vævskonstruktion. TGF-β1 er en vækstfaktor, der anvendes til at fremme helingsprocessen af osteochondrale defekter, tilskynde til chondrocyt og hMSC-spredning og differentiering^21,22. TGF-β1 spiller således en nøglerolle i bruskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)²³, hvilket tilskynder til korrekt vækst, især når den er lokaliseret inden for JBNm-lagene.

Som tidligere nævnt samles vækstfaktorer typisk på ydersiden af stilladser uden specifikke metoder til inkorporering. Her, med biomaterialernes præcist designede nanoarkitektur, blev JBNm udviklet til specifik målretning af tilsigtede celler og væv. JBNm består af TGF-β1 klæbet på JBNt-overflader i det indre lag og matrilin-3 klæbet på JBNt-overflader i det ydre lag^24,25. Inkorporeringen af TGF-β1 i det indre lag af lag-for-lag-strukturen muliggør et stærkt lokaliseret mikromiljø langs JBNm-fibrene, hvilket skaber en homeostatisk vævskonstruktion med en meget langsommere frigivelse af proteinet¹². JBNm’s injicerbarhed gør det til en ideel bruskvævskonstruktion til forskellige fremtidige biomaterialeanvendelser²⁶.

Protocol

1. Syntese af JBNts Forbered JBNt-monomeren ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder, der involverer syntesen af en række forbindelser12. Rens rå JBNt-monomer, efter at den er blevet syntetiseret med højtydende væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en omvendt fasekolonne. Brug opløsningsmiddel A: 100% vand, opløsningsmiddel B: 100% acetonitril og opløsningsmiddel C: HCI-vandopløsning med pH = 1. Brug en strømningshastighed på 3 ml/min. Saml de…

Representative Results

Efter protokollen blev JBNts med succes syntetiseret og karakteriseret med UV-Vis-absorption og TEM. JBNm er et injicerbart fast stillads, der gennemgår en hurtig biomimetisk proces. Efter at JBNts blev tilsat til en blanding af TGF-β1/matrilin-3-opløsning i et fysiologisk miljø, blev der dannet et fast hvidmasket stillads, der indikerer den vellykkede samling af JBNm, som det ses i figur 1. Dette blev demonstreret i karakteriseringsmetoderne. Under fysiologis…

Discussion

Målet med denne undersøgelse er at udvikle en biomimetisk stilladsplatform, JBNm, for at overvinde begrænsningerne ved konventionelle vævskonstruktioner, der er afhængige af cellekulturmiljøer for at formidle celledifferentiering. JBNm er et lag-for-lag strukturstillads til en selvbærende bruskvævskonstruktion. Det innovative design er baseret på nye DNA-inspirerede nanomaterialer, JBNts. JBNm, der består af JBNts³⁰, TGF-β1 og matrilin-3, er samlet gennem en ny lag-for-lag-teknik, hvor …

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.