Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Summary

Questo protocollo descrive l’assemblaggio di un’impalcatura a nano-matrice di base Janus (JBNm) strato per strato aggiungendo sequenzialmente nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1). Il JBNm è stato fabbricato e caratterizzato; Inoltre, ha mostrato un’eccellente bioattività, incoraggiando le funzioni cellulari come l’adesione, la proliferazione e la differenziazione.

Abstract

Sono stati sviluppati vari scaffold di biomateriali per guidare l’adesione e la proliferazione cellulare nella speranza di promuovere funzioni specifiche per usi in vitro e in vivo . L’aggiunta di fattori di crescita in questi scaffold di biomateriali viene generalmente effettuata per fornire un ambiente di coltura cellulare ottimale, mediando la differenziazione cellulare e le sue successive funzioni. Tuttavia, i fattori di crescita in uno scaffold di biomateriale convenzionale sono tipicamente progettati per essere rilasciati al momento dell’impianto, il che potrebbe causare effetti collaterali non intenzionali sui tessuti o sulle cellule circostanti. Qui, la nano-matrice di base Janus ispirata al DNA (JBNm) ha ottenuto con successo un microambiente altamente localizzato con una struttura strato per strato per costrutti di tessuto cartilagineo autosostenibili. I JBNm sono auto-assemblati da nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1) tramite bioaffinità. Il JBNm è stato assemblato con un rapporto TGF-β1:matrilin-3:JBNt di 1:4:10, poiché questo è stato il rapporto determinato al quale potrebbe avvenire un corretto assemblaggio nella struttura strato per strato. In primo luogo, la soluzione TGF-β1 è stata aggiunta alla soluzione di matrilina-3. Quindi, questa miscela è stata pipettata più volte per garantire una sufficiente omogeneità prima dell’aggiunta della soluzione JBNt. Questo ha formato il JBNm strato per strato, dopo aver pipettettato più volte di nuovo. Sono stati eseguiti una varietà di esperimenti per caratterizzare la struttura JBNm strato per strato, JBNts da solo, matrilina-3 da solo, e TGF-β1 da solo. La formazione di JBNm è stata studiata con spettri di assorbimento UV-Vis e la struttura del JBNm è stata osservata con microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Poiché l’innovativa impalcatura JBNm strato per strato si forma su scala molecolare, è stato possibile osservare il JBNm marcato con colorante fluorescente. Il TGF-β1 è confinato all’interno dello strato interno del JBNm iniettabile, che può impedire il rilascio di fattori di crescita nelle aree circostanti, promuovere la condrogenesi localizzata e promuovere un microambiente anti-ipertrofico.

Introduction

Gli scaffold nell’ingegneria tissutale svolgono un ruolo vitale nel fornire supporto strutturale per l’attaccamento cellulare e il successivo sviluppo tissutale¹. Tipicamente, i costrutti tissutali convenzionali senza alcuna impalcatura si basano sull’ambiente di coltura cellulare e sui fattori di crescita aggiunti per mediare la differenziazione cellulare. Inoltre, questa aggiunta di molecole bioattive negli scaffold è spesso l’approccio preferito nel guidare la differenziazione e la funzione cellulare ^2,3. Alcuni scaffold possono imitare il microambiente biochimico dei tessuti nativi in modo indipendente, mentre altri possono influenzare direttamente le funzioni cellulari attraverso fattori di crescita. Tuttavia, i ricercatori incontrano spesso sfide nella selezione di scaffold che potrebbero influenzare positivamente l’adesione, la crescita e la differenziazione cellulare, fornendo al contempo supporto strutturale e stabilità ottimali per un lungo periodo ^4,5. Le molecole bioattive sono spesso legate liberamente allo scaffold portando a un rapido rilascio di queste proteine al momento dell’impianto, con conseguente rilascio in posizioni indesiderate. Ciò culmina in effetti collaterali su tessuti o cellule che non sono stati intenzionalmente mirati ^6,7.

Gli scaffold sono tipicamente realizzati con materiali polimerici. La nano-matrice di base Janus (JBNm) è una piattaforma di scaffold biomimetica creata con un nuovo metodo strato per strato per il costrutto autosostenibile del tessuto cartilagineo⁸. Questi nuovi nanotubi ispirati al DNA sono stati chiamati Janus base nanotubes (JBNts), poiché imitano correttamente la struttura e la chimica superficiale del collagene presente nella matrice extracellulare (ECM). Con l’aggiunta di molecole bioattive, come la matrilina-3 e il fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1), il JBNm può creare un microambiente ottimale che può quindi stimolare la funzionalità cellulare e tissutale desiderata⁹.

I JBNt sono nuovi nanotubi derivati da versioni sintetiche della nucleobase adenina e della timina. I JBNt sono formati attraverso l’auto-assemblaggio¹⁰; Sei nucleobasi sintetiche si legano per formare un anello, e questi anelli subiscono interazioni di impilamento π-π per creare un nanotubo di 200-300 μm di lunghezza¹¹. Questi nanotubi sono strutturalmente simili alle proteine del collagene; imitando un aspetto del microambiente cartilagineo nativo, i JBNt hanno dimostrato di fornire un sito di attacco favorevole per i condrociti e le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)^11,12,13,14. Poiché i nanotubi subiscono l’auto-assemblaggio e non richiedono alcun tipo di iniziatore (come la luce UV), mostrano un potenziale entusiasmante come impalcatura iniettabile per aree difettose difficili da raggiungere¹⁵.

La matrilina-3 è una proteina strutturale della matrice extracellulare presente nella cartilagine. Questa proteina svolge un ruolo significativo nella condrogenesi e nella corretta funzione della cartilagine^16,17. Recentemente, è stato incluso negli scaffold di biomateriali, favorendo la condrogenesi senza ipertrofia 9,18,19. Includendo questa proteina nel JBNm, le cellule della cartilagine sono attratte da un’impalcatura che contiene componenti simili a quelli del suo microambiente nativo. Inoltre, è stato dimostrato che la matrilina-3 è necessaria per una corretta segnalazione del TGF-β1 all’interno dei condrociti²⁰. I fattori di crescita funzionano come molecole di segnalazione, causando la crescita specifica di una determinata cellula o tessuto. Pertanto, per ottenere una rigenerazione ottimale della cartilagine, matrilina-3 e TGF-β1 sono componenti essenziali all’interno del JBNm. L’aggiunta di TGF-β1 nello scaffold strato per strato può promuovere ulteriormente la rigenerazione della cartilagine in un costrutto tissutale. Il TGF-β1 è un fattore di crescita impiegato per favorire il processo di guarigione dei difetti osteocondrali, favorendo la proliferazione e la differenziazione dei condrociti e delle hMSC^21,22. Pertanto, TGF-β1 svolge un ruolo chiave nella rigenerazione della cartilagine JBNm (J/T/M JBNm)²³, incoraggiando una corretta crescita soprattutto quando è localizzato all’interno degli strati JBNm.

Come accennato in precedenza, i fattori di crescita sono tipicamente assemblati all’esterno delle impalcature senza metodi specifici di incorporazione. Qui, con la nano-architettura progettata con precisione dei biomateriali, il JBNm è stato sviluppato per il targeting specifico delle cellule e dei tessuti previsti. Il JBNm è composto da TGF-β1 aderito su superfici JBNt nello strato interno e matrilina-3 aderente su superfici JBNt nello strato esterno^24,25. L’incorporazione di TGF-β1 nello strato interno della struttura strato per strato consente un microambiente altamente localizzato lungo le fibre JBNm, creando un costrutto tissutale omeostatico con un rilascio molto più lento della proteina¹². L’iniettabilità del JBNm lo rende un costrutto di tessuto cartilagineo ideale per varie applicazioni future di biomateriali²⁶.

Protocol

1. Sintesi di JBNts Preparare il monomero JBNt utilizzando metodi precedentemente pubblicati, che coinvolgono la sintesi di una varietà di composti12. Purificare il monomero JBNt grezzo dopo che è stato sintetizzato con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna di fase inversa. Utilizzare solvente A: 100% acqua, solvente B: 100% acetonitrile e solvente C: soluzione acquosa HCl con pH = 1. Utilizzare una portata di 3 ml/min. Racc…

Representative Results

Seguendo il protocollo, i JBNt sono stati sintetizzati con successo e caratterizzati con assorbimento UV-Vis e TEM. Il JBNm è un’impalcatura solida iniettabile che subisce un rapido processo biomimetico. Dopo che i JBNt sono stati aggiunti a una miscela di soluzione di TGF-β1/matrilina-3 in un ambiente fisiologico, si è formata un’impalcatura solida a maglia bianca che indica il successo dell’assemblaggio di JBNm, come si vede nella Figura 1. Ciò è stato dimostrato nei metodi di caratte…

Discussion

L’obiettivo di questo studio è sviluppare una piattaforma di scaffold biomimetico, il JBNm, per superare i limiti dei costrutti tissutali convenzionali che si basano su ambienti di coltura cellulare per mediare la differenziazione cellulare. Il JBNm è un’impalcatura a struttura strato per strato per un costrutto di tessuto cartilagineo autosufficiente. Il design innovativo si basa su nuovi nanomateriali ispirati al DNA, i JBNts. Il JBNm, composto da JBNts³⁰, TGF-β1 e matrilina-3, è assemblato …

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.