연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석
Summary
이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.
Abstract
다양한 생체 재료 스캐폴드는 시험관내 및 생체 내 사용을 위한 특정 기능을 촉진하기 위해 세포 부착 및 증식을 안내하기 위해 개발되었습니다. 이러한 생체 재료 스캐폴드 내로의 성장 인자의 첨가는 일반적으로 최적의 세포 배양 환경을 제공하고, 세포 분화 및 그 후속 기능을 매개하기 위해 수행된다. 그러나, 종래의 생체 재료 스캐폴드 내의 성장 인자는 전형적으로 이식시 방출되도록 설계되어, 주변 조직 또는 세포에 의도하지 않은 부작용을 초래할 수 있다. 여기에서 DNA에서 영감을 받은 야누스 염기 나노매트릭스(JBNm)는 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조로 고도로 국소화된 미세 환경을 성공적으로 달성했습니다. JBNms는 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 생체 친화도를 통해 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)에서 자체 조립됩니다. JBNm은 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 비율이 1:4:10으로 조립되었는데, 이는 층별 구조로의 적절한 조립이 발생할 수 있는 결정된 비율이기 때문입니다. 먼저, TGF-β1 용액을 마트릴린-3 용액에 첨가하였다. 이어서, 이 혼합물을 JBNt 용액의 첨가 전에 충분한 균질성을 보장하기 위해 수회 피펫팅하였다. 이것은 여러 번 다시 피펫팅한 후 층별 JBNm을 형성했습니다. 층별 JBNm 구조, JBNt 단독, 마트릴린-3 단독, 및 TGF-β1 단독을 특성화하기 위해 다양한 실험을 수행하였다. JBNm의 형성은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 연구되었고, JBNm의 구조는 투과 전자 현미경 (TEM)으로 관찰되었습니다. 혁신적인 층별 JBNm 스캐폴드가 분자 규모로 형성됨에 따라 형광 염료 표지 JBNm을 관찰할 수 있었습니다. TGF-β1은 주사 가능한 JBNm의 내부 층 내에 국한되어 주변 부위로의 성장 인자 방출을 방지하고 국소 연골 생성을 촉진하며 항 비대 미세 환경을 촉진 할 수 있습니다.
Introduction
조직 공학의 스캐폴드는 세포 부착 및 후속조직 발달을 위한 구조적 지지를 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 전형적으로, 어떠한 스캐폴딩도 없는 종래의 조직 구축물은 세포 배양 환경에 의존하고 세포 분화를 매개하기 위해 추가된 성장 인자에 의존한다. 또한, 스캐폴드에 생리활성 분자를 추가하는 것은 종종 세포 분화 및 기능 2,3을 안내하는 데 선호되는 접근 방식입니다. 일부 스캐폴드는 네이티브 조직의 생화학적 미세 환경을 독립적으로 모방할 수 있는 반면, 다른 스캐폴드는 성장 인자를 통해 세포 기능에 직접 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 연구자들은 종종 세포 부착, 성장 및 분화에 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 스캐폴드를 선택하는 데 어려움을 겪는 동시에장기간에 걸쳐 최적의 구조적 지지와 안정성을 제공합니다4,5. 생리 활성 분자는 종종 스캐폴드에 느슨하게 결합되어 이식시 이러한 단백질이 빠르게 방출되어 원치 않는 위치에서 방출됩니다. 이것은 의도적으로 표적화되지 않은 조직이나 세포에 대한 부작용으로 절정에 달합니다 6,7.
비계는 일반적으로 고분자 재료로 만들어집니다. 야누스 베이스 나노-매트릭스(JBNm)는 자가 지속 가능한 연골 조직 구축물8을 위한 새로운 층별 방법으로 만들어진 생체모방 스캐폴드 플랫폼이다. 이 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노튜브는 세포외 기질(ECM)에서 발견되는 콜라겐의 구조와 표면 화학을 적절하게 모방하기 때문에 야누스 베이스 나노튜브(JBNts)로 명명되었습니다. JBNm은 matrilin-3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)과 같은 생리 활성 분자를 첨가하여 원하는 세포 및 조직 기능을 자극 할 수있는 최적의 미세 환경을 만들 수 있습니다9.
JBNts는 핵염기 아데닌과 티민의 합성 버전에서 파생 된 새로운 나노 튜브입니다. JBNts는 자체 조립(10)을 통해 형성됩니다. 6 개의 합성 핵염기가 결합하여 고리를 형성하고,이 고리는 π-π 스태킹 상호 작용을 거쳐 길이 200-300 μm의 나노 튜브를 만듭니다11. 이 나노 튜브는 구조적으로 콜라겐 단백질과 유사합니다. 천연 연골 미세 환경의 한 측면을 모방함으로써 JBNts는 연골 세포 및 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)에 유리한 부착 부위를 제공하는 것으로 나타났습니다11,12,13,14. 나노 튜브는 자체 조립을 거치고 어떤 종류의 개시제 (예 : 자외선)도 필요로하지 않기 때문에 도달하기 어려운 결함 영역15에 대한 주사 가능한 스캐 폴드로서의 흥미로운 잠재력을 보여줍니다.
Matrilin-3는 연골에서 발견되는 구조적 세포 외 기질 단백질입니다. 이 단백질은 연골 형성과 적절한 연골 기능에 중요한 역할을합니다16,17. 최근에는 생체 재료 스캐폴드에 포함되어 비대 9,18,19 없이 연골 생성을 촉진합니다. 이 단백질을 JBNm에 포함시킴으로써 연골 세포는 천연 미세 환경과 유사한 구성 요소를 포함하는 스캐 폴드에 끌립니다. 또한, 마트리린-3은 연골세포20 내에서 적절한 TGF-β1 신호전달을 위해 필요한 것으로 나타났다. 성장 인자는 신호 분자로 기능하여 특정 세포 또는 조직의 특정 성장을 유발합니다. 따라서 최적의 연골 재생을 달성하기 위해 매트릴린-3 및 TGF-β1은 JBNm 내의 필수 구성 요소입니다. 층별 스캐폴드 내로 TGF-β1을 첨가하면 조직 구축물에서 연골 재생을 더욱 촉진할 수 있다. TGF-β1은 연골 결손의 치유 과정을 촉진하고 연골 세포 및 hMSC 증식 및 분화를 촉진하는 데 사용되는 성장 인자입니다21,22. 따라서 TGF-β1은 연골 재생 JBNm (J / T / M JBNm) 23에서 중요한 역할을하며, 특히 JBNm 층 내에 국한 될 때 적절한 성장을 촉진합니다.
앞서 언급했듯이 성장 인자는 일반적으로 특정 혼입 방법 없이 스캐폴드 외부에 조립됩니다. 여기에서 생체 재료의 정밀하게 설계된 나노 아키텍처를 통해 JBNm은 의도된 세포와 조직의 특정 표적화를 위해 개발되었습니다. JBNm은 내층의 JBNt 표면에 부착된 TGF-β1과 외층(24,25)의 JBNt 표면에 부착된 마트릴린-3으로 구성된다. 층별 구조의 내부 층에 TGF-β1을 혼입하면 JBNm 섬유를 따라 고도로 국소화된 미세 환경을 허용하여 단백질12의 훨씬 느린 방출을 갖는 항상성 조직 구축물을 생성합니다. JBNm의 주입성은 다양한 미래의 생체 재료 응용 분야에 이상적인 연골 조직 구조물입니다26.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구의 목표는 세포 분화를 매개하기 위해 세포 배양 환경에 의존하는 기존 조직 구축물의 한계를 극복하기 위해 생체 모방 스캐폴드 플랫폼인 JBNm을 개발하는 것입니다. JBNm은 자체 지속 가능한 연골 조직 구조를 위한 층별 구조 스캐폴드입니다. 혁신적인 디자인은 새로운 DNA에서 영감을 받은 나노 물질인 JBNts를 기반으로 합니다. JBNts30, TGF-β1 및 matrilin-3으로 구성된 JBNm은 스…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 7R01AR072027 및 7R03AR069383, NSF 경력 상 1905785, NSF 2025362 및 코네티컷 대학교의 지원을 받습니다. 이 작업은 NIH 보조금 S10OD016435에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
Referências
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