Fabrikasjon og karakterisering av lag-for-lag Janus base nano-matrise for å fremme brusk regenerering

Summary

Denne protokollen beskriver montering av en lag-for-lag Janus base nano-matrise (JBNm) stillas ved å legge Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekvensielt. JBNm ble fabrikkert og karakterisert; I tillegg viste den utmerket bioaktivitet, oppmuntrende cellefunksjoner som vedheft, proliferasjon og differensiering.

Abstract

Ulike stillas biomateriale er utviklet for å veilede celleadhesjon og proliferasjon i håp om å fremme spesifikke funksjoner for in vitro og in vivo bruk. Tilsetningen av vekstfaktorer i disse biomaterialestillasene gjøres vanligvis for å gi et optimalt cellekulturmiljø, formidle celledifferensiering og dets påfølgende funksjoner. Imidlertid er vekstfaktorene i et konvensjonelt biomateriale stillas vanligvis designet for å frigjøres ved implantasjon, noe som kan føre til utilsiktede bivirkninger på omgivende vev eller celler. Her har den DNA-inspirerte Janus base nano-matrisen (JBNm) vellykket oppnådd et svært lokalisert mikromiljø med en lag-for-lag-struktur for selvbærekraftige bruskvevskonstruksjoner. JBNms er selvmontert fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3, og transformerende vekstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm ble montert i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har vært det bestemte forholdet der riktig montering i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først ble TGF-β1-løsningen lagt til matrilin-3-løsningen. Deretter ble denne blandingen pipettert flere ganger for å sikre tilstrekkelig homogenitet før tilsetning av JBNt-løsningen. Dette dannet lag-for-lag JBNm, etter pipettering flere ganger igjen. En rekke eksperimenter ble utført for å karakterisere lag-for-lag JBNm-strukturen, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen av JBNm ble studert med UV-Vis absorpsjonsspektra, og strukturen til JBNm ble observert med transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Når det innovative lag-for-lag JBNm-stillaset dannes på molekylær skala, kan det fluorescerende fargestoffmerkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrenset i det indre laget av den injiserbare JBNm, som kan forhindre frigjøring av vekstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokalisert kondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Introduction

Stillas i vevsteknikk spiller en viktig rolle i å gi strukturell støtte til cellefeste og påfølgende vevsutvikling¹. Vanligvis er konvensjonelle vevskonstruksjoner uten stillas avhengig av cellekulturmiljøet og tilførte vekstfaktorer for å formidle celledifferensiering. Videre er denne tilsetningen av bioaktive molekyler i stillaser ofte den foretrukne tilnærmingen for å lede celledifferensiering og funksjon ^2,3. Noen stillaser kan etterligne det biokjemiske mikromiljøet i innfødte vev uavhengig, mens andre kan direkte påvirke cellefunksjoner via vekstfaktorer. Imidlertid møter forskere ofte utfordringer ved valg av stillaser som kan påvirke celleadhesjon, vekst og differensiering positivt, samtidig som det gir optimal strukturell støtte og stabilitet over en lang periode ^4,5. De bioaktive molekylene er ofte løst bundet til stillaset, noe som fører til rask frigjøring av disse proteinene ved implantasjon, noe som resulterer i frigjøring på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på vev eller celler som ikke med vilje var målrettet ^6,7.

Stillaser er vanligvis laget av polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stillasplattform laget med en ny lag-for-lag-metode for selvbærende bruskvevskonstruksjon⁸. Disse nye DNA-inspirerte nanorørene har blitt kalt Janus base nanorør (JBNts), da de riktig etterligner strukturen og overflatekjemien til kollagen som finnes i den ekstracellulære matrisen (ECM). Med tilsetning av bioaktive molekyler, som matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skape et optimalt mikromiljø som deretter kan stimulere ønsket celle- og vevsfunksjonalitet⁹.

JBNts er nye nanorør avledet fra syntetiske versjoner av nukleobase adenin og tymin. JBNts dannes gjennom selvmontering¹⁰; Seks syntetiske nukleobaser bindes for å danne en ring, og disse ringene gjennomgår π-π stablingsinteraksjoner for å skape et nanorør 200-300 μm i lengde¹¹. Disse nanorørene er strukturelt lik kollagenproteiner; ved å etterligne et aspekt av det innfødte bruskmikromiljøet, har JBNts vist seg å gi et gunstig festested for kondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSCs)^11,12,13,14. Fordi nanorørene gjennomgår selvmontering og ikke krever noen form for initiator (for eksempel UV-lys), viser de spennende potensial som et injiserbart stillas for vanskelig tilgjengelige defektområder¹⁵.

Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matriksprotein som finnes i brusk. Dette proteinet spiller en viktig rolle i kondrogenese og riktig bruskfunksjon^16,17. Nylig har det blitt inkludert i biomateriale stillaser, oppmuntrende kondrogenese uten hypertrofi 9,18,19. Ved å inkludere dette proteinet i JBNm, tiltrekkes bruskceller til et stillas som inneholder lignende komponenter som det opprinnelige mikromiljøet. I tillegg har det vist seg at matrilin-3 er nødvendig for riktig TGF-β1-signalering i kondrocytter²⁰. Vekstfaktorer fungerer som signalmolekyler, noe som forårsaker spesifikk vekst av en bestemt celle eller vev. For å oppnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 essensielle komponenter i JBNm. Tilsetningen av TGF-β1 i lag-for-lag-stillaset kan ytterligere fremme bruskregenerering i en vevskonstruksjon. TGF-β1 er en vekstfaktor som brukes til å oppmuntre helbredelsesprosessen av osteokondrale defekter, oppmuntre kondrocytt og hMSC-spredning og differensiering^21,22. Dermed spiller TGF-β1 en nøkkelrolle i bruskregenerering JBNm (J / T / M JBNm) ²³, og oppmuntrer til riktig vekst, spesielt når den er lokalisert i JBNm-lagene.

Som nevnt tidligere er vekstfaktorer vanligvis samlet på utsiden av stillas uten spesifikke metoder for inkorporering. Her, med den nøyaktig utformede nanoarkitekturen til biomaterialene, ble JBNm utviklet for spesifikk målretting av tiltenkte celler og vev. JBNm består av TGF-β1 festet på JBNt-overflater i det indre laget og matrilin-3 festet på JBNt-overflater i det ytre laget^24,25. Inkorporeringen av TGF-β1 i det indre laget av lag-for-lag-strukturen muliggjør et svært lokalisert mikromiljø langs JBNm-fibrene, og skaper en homeostatisk vevskonstruksjon med en mye langsommere frigjøring av proteinet¹². Injiserbarheten til JBNm gjør den til en ideell bruskvevskonstruksjon for ulike fremtidige biomaterialeapplikasjoner²⁶.

Protocol

1. Syntese av JBNts Forbered JBNt-monomeren ved bruk av tidligere publiserte metoder, som involverer syntese av en rekke forbindelser12. Rens rå JBNt-monomer etter at den har blitt syntetisert med høyytelses væskekromatografi (HPLC) ved hjelp av en omvendt fasekolonne. Bruk løsningsmiddel A: 100% vann, løsningsmiddel B: 100% acetonitril og løsningsmiddel C: HCl vannoppløsning med pH = 1. Bruk en strømningshastighet på 3 ml/min. Samle den største toppe…

Representative Results

Etter protokollen ble JBNts vellykket syntetisert og karakterisert med UV-Vis-absorpsjon og TEM. JBNm er et injiserbart fast stillas som gjennomgår en rask biomimetisk prosess. Etter at JBNts ble tilsatt til en blanding av TGF-β1 / matrilin-3-løsning i et fysiologisk miljø, ble det dannet et solidt hvitmasket stillas som indikerer vellykket montering av JBNm, som vist i figur 1. Dette ble demonstrert i karakteriseringsmetodene. Under fysiologiske forhold er ma…

Discussion

Målet med denne studien er å utvikle en biomimetisk stillasplattform, JBNm, for å overvinne begrensningene i konvensjonelle vevskonstruksjoner som er avhengige av cellekulturmiljøer for å formidle celledifferensiering. JBNm er et lag-for-lag struktur stillas for en selvbærende bruskvevskonstruksjon. Den innovative designen er basert på nye DNA-inspirerte nanomaterialer, JBNts. JBNm, sammensatt av JBNts³⁰, TGF-β1 og matrilin-3, er satt sammen gjennom en ny lag-for-lag-teknikk der stillasets…

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.