Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem

Summary

Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.

Abstract

Vários andaimes de biomateriais foram desenvolvidos para orientar a adesão e proliferação celular, na esperança de promover funções específicas para usos in vitro e de vivo. A adição de fatores de crescimento a esses andaimes de biomateriais é geralmente feita para fornecer um ambiente ideal de cultura celular, mediando a diferenciação celular e suas funções subsequentes. No entanto, os fatores de crescimento em um andaime de biomaterial convencional são tipicamente projetados para serem liberados após a implantação, o que pode resultar em efeitos colaterais não intencionais no tecido ou nas células circundantes. Aqui, a nanomatriz de base Janus inspirada no DNA (JBNm) alcançou com sucesso um microambiente altamente localizado com uma estrutura camada por camada para construções de tecido cartilaginoso autossustentáveis. Os JBNms são auto-montados a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e fator de crescimento transformador beta-1 (TGF-β1) via bioafinidade. O JBNm foi montado na proporção TGF-β1:matrilina-3:JBNt de 1:4:10, pois esta foi a razão determinada na qual a montagem adequada na estrutura camada por camada poderia ocorrer. Primeiramente, a solução de TGF-β1 foi adicionada à solução de matrilina-3. Em seguida, esta mistura foi pipetada várias vezes para garantir homogeneidade suficiente antes da adição da solução JBNt. Isso formou o JBNm camada por camada, depois de pipetar várias vezes novamente. Uma variedade de experimentos foi realizada para caracterizar a estrutura JBNm camada por camada, JBNts sozinho, matrilina-3 sozinho e TGF-β1 sozinho. A formação do JBNm foi estudada com espectros de absorção UV-Vis, e a estrutura do JBNm foi observada com microscopia eletrônica de transmissão (MET). À medida que o inovador andaime JBNm camada por camada é formado em escala molecular, o JBNm marcado com corante fluorescente pôde ser observado. O TGF-β1 é confinado dentro da camada interna do JBNm injetável, o que pode impedir a liberação de fatores de crescimento para áreas circundantes, promover condrogênese localizada e promover um microambiente anti-hipertrófico.

Introduction

Os andaimes na engenharia de tecidos desempenham um papel vital no fornecimento de suporte estrutural para a fixação celular e subsequente desenvolvimento tecidual¹. Normalmente, as construções de tecidos convencionais sem qualquer andaime dependem do ambiente de cultura celular e adicionam fatores de crescimento para mediar a diferenciação celular. Além disso, essa adição de moléculas bioativas em andaimes é frequentemente a abordagem preferida para orientar a diferenciação e a função celular ^2,3. Alguns andaimes podem imitar o microambiente bioquímico dos tecidos nativos de forma independente, enquanto outros podem influenciar diretamente as funções celulares através de fatores de crescimento. No entanto, os pesquisadores frequentemente encontram desafios na seleção de andaimes que poderiam afetar positivamente a adesão, o crescimento e a diferenciação celular, ao mesmo tempo em que fornecem suporte estrutural e estabilidade ideais por um longo período ^4,5. As moléculas bioativas são muitas vezes frouxamente ligadas ao andaime, levando à rápida liberação dessas proteínas após a implantação, resultando em sua liberação em locais indesejados. Isso culmina em efeitos colaterais em tecidos ou células que não foram intencionalmente direcionados ^6,7.

Os andaimes são tipicamente feitos de materiais poliméricos. A nanomatriz de base Janus (JBNm) é uma plataforma de andaime biomimético criada com um novo método camada por camada para construção de tecido cartilaginoso autossustentável⁸. Esses novos nanotubos inspirados em DNA foram nomeados nanotubos de base Janus (JBNts), pois imitam adequadamente a estrutura e a química da superfície do colágeno encontrada na matriz extracelular (ECM). Com a adição de moléculas bioativas, como a matrilina-3 e o Fator Transformador de Crescimento Beta-1 (TGF-β1), o JBNm pode criar um microambiente ideal que pode, então, estimular a funcionalidade celular e tecidual desejada⁹.

JBNts são novos nanotubos derivados de versões sintéticas da nucleobase adenina e timina. Os JBNts são formados através da auto-montagem¹⁰; seis nucleobases sintéticas se ligam para formar um anel, e esses anéis sofrem interações de empilhamento π-π para criar um nanotubo de 200-300 μm de comprimento¹¹. Estes nanotubos são estruturalmente semelhantes às proteínas de colagénio; ao imitar um aspecto do microambiente da cartilagem nativa, os JBNts demonstraram fornecer um local de fixação favorável para condrócitos e células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs)^11,12,13,14. Como os nanotubos são submetidos à automontagem e não requerem nenhum tipo de iniciador (como a luz UV), eles mostram um potencial excitante como um andaime injetável para áreas de defeitos de difícil acesso¹⁵.

A matrilina-3 é uma proteína da matriz extracelular estrutural encontrada na cartilagem. Essa proteína desempenha um papel significativo na condrogênese e na função adequada da cartilagem^16,17. Recentemente, tem sido incluída em andaimes de biomateriais, incentivando a condrogênese sem hipertrofia 9,18,19. Ao incluir esta proteína no JBNm, as células da cartilagem são atraídas por um andaime que contém componentes semelhantes ao do seu microambiente nativo. Além disso, foi demonstrado que a matrilina-3 é necessária para a sinalização adequada do TGF-β1 dentro dos condrócitos²⁰. Os fatores de crescimento funcionam como moléculas de sinalização, causando o crescimento específico de uma determinada célula ou tecido. Assim, para alcançar a regeneração ideal da cartilagem, a matrilina-3 e o TGF-β1 são componentes essenciais dentro do JBNm. A adição de TGF-β1 no andaime camada por camada pode promover ainda mais a regeneração da cartilagem em uma construção de tecido. O TGF-β1 é um fator de crescimento empregado para incentivar o processo de cicatrização de defeitos osteocondrais, incentivando a proliferação e diferenciação de condrócitos e hMSC^21,22. Assim, o TGF-β1 desempenha um papel fundamental na regeneração da cartilagem JBNm (J/T/M JBNm)²³, incentivando o crescimento adequado, especialmente quando está localizado dentro das camadas JBNm.

Como mencionado anteriormente, os fatores de crescimento são tipicamente montados do lado de fora dos andaimes sem métodos específicos de incorporação. Aqui, com a nanoarquitetura precisamente projetada dos biomateriais, o JBNm foi desenvolvido para o direcionamento específico de células e tecidos pretendidos. O JBNm é composto por TGF-β1 aderido em superfícies JBNt na camada interna e matrilina-3 aderido em superfícies JBNt na camada externa^24,25. A incorporação do TGF-β1 na camada interna da estrutura camada por camada permite um microambiente altamente localizado ao longo das fibras JBNm, criando uma construção tecidual homeostática com uma liberação muito mais lenta da proteína¹². A injetabilidade do JBNm o torna uma construção de tecido cartilaginoso ideal para várias aplicações futuras de biomateriais²⁶.

Protocol

1. Síntese dos JBNts Preparar o monômero JBNt utilizando métodos previamente publicados, envolvendo a síntese de uma variedade de compostos12. Purificar o monómero bruto JBNt depois de ter sido sintetizado com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna de fase reversa. Use o solvente A: 100% água, o solvente B: 100% acetonitrila e o solvente C: solução de água HCl com pH = 1. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Coletar o mai…

Representative Results

Seguindo o protocolo, os JBNts foram sintetizados com sucesso e caracterizados com absorção de UV-Vis e MET. O JBNm é um andaime sólido injetável que passa por um rápido processo biomimético. Após a adição de JBNts a uma mistura de solução de TGF-β1/matrilina-3 em ambiente fisiológico, formou-se um andaime sólido de malha branca, indicando a montagem bem-sucedida do JBNm, como pode ser observado na Figura 1. Isso foi demonstrado nos métodos de caracterização. <p class="…

Discussion

O objetivo deste estudo é desenvolver uma plataforma de andaimes biomiméticos, o JBNm, para superar as limitações dos construtos teciduais convencionais que dependem de ambientes de cultura celular para mediar a diferenciação celular. O JBNm é um andaime de estrutura camada por camada para uma construção de tecido cartilaginoso autossustentável. O design inovador é baseado em novos nanomateriais inspirados no DNA, os JBNts. O JBNm, composto por JBNts³⁰, TGF-β1 e matrilina-3, é montado…

Materials

10 % Normal Goat Serum	Thermo Fisher	50062Z	Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate	Corning	07-200-740	24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate	Thermo Fisher	262260	384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass	Thermo Fisher	155409PK	8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom	Corning	07-200-91	96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated	Thermo Fisher	260895	96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit	Thermo Fisher	A30006 (488) and A30007 (555)	Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody	Thermo Fisher	41-9771-82	Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine	Bio-Rad		Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line			Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8	Milipore Sigma	96992	Cell proliferation assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome			Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes	FISHER Scientific	14-955-128	Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium	Thermo Fisher	10566032	Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A4766801	Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium	Thermo Fisher	00-4958-02	Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde			Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody	Thermo Fisher	A16110	Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells	LONZA	PT-2501	Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium	LONZA	PT-3003	Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts)			Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope	Tecnai		Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB	MathWorks		Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher		Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope	Nikon	A1R HD25	Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass	Thermo Fisher	152250	Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent			Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	10010023	Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin	Invitrogen	R415	F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution			Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit	Invitrogen	BMS249-4	Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.