Tillverkning och karakterisering av lager-för-lager Janus Base Nano-Matrix för att främja broskregenerering
Summary
Detta protokoll beskriver sammansättningen av en lager-för-lager Janus-bas nano-matris (JBNm) ställning genom att lägga till Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor Beta-1 (TGF-β1) sekventiellt. JBNm tillverkades och karakteriserades; Dessutom visade den utmärkt bioaktivitet, uppmuntrande cellfunktioner som vidhäftning, proliferation och differentiering.
Abstract
Olika biomaterialställningar har utvecklats för att styra celladhesion och proliferation i hopp om att främja specifika funktioner för in vitro – och in vivo-användning . Tillsatsen av tillväxtfaktorer i dessa biomaterialställningar görs i allmänhet för att ge en optimal cellodlingsmiljö, förmedla celldifferentiering och dess efterföljande funktioner. Tillväxtfaktorerna i en konventionell biomaterialställning är dock vanligtvis utformade för att frigöras vid implantation, vilket kan leda till oavsiktliga biverkningar på omgivande vävnad eller celler. Här har den DNA-inspirerade Janus-basnanomatrisen (JBNm) framgångsrikt uppnått en mycket lokaliserad mikromiljö med en lager-för-lager-struktur för självhållbara broskvävnadskonstruktioner. JBNms är självmonterade från Janus basnanorör (JBNts), matrilin-3 och transformerande tillväxtfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm monterades med ett TGF-β1: matrilin-3: JBNt-förhållande på 1: 4: 10, eftersom detta har varit det bestämda förhållandet vid vilket korrekt montering i lager-för-lager-strukturen kunde inträffa. Först tillsattes TGF-β1-lösningen till matrilin-3-lösningen. Därefter pipetterades denna blandning flera gånger för att säkerställa tillräcklig homogenitet före tillsatsen av JBNt-lösningen. Detta bildade lager-för-lager JBNm, efter pipettering flera gånger igen. En mängd olika experiment utfördes för att karakterisera skikt-för-lager JBNm-strukturen, JBNts ensam, matrilin-3 ensam och TGF-β1 ensam. Bildandet av JBNm studerades med UV-Vis-absorptionsspektra, och strukturen hos JBNm observerades med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Eftersom den innovativa lager-för-lager JBNm-ställningen bildas i molekylär skala kunde den fluorescerande färgämnesmärkta JBNm observeras. TGF-β1 är begränsad i det inre skiktet av den injicerbara JBNm, som kan förhindra frisättning av tillväxtfaktorer till omgivande områden, främja lokaliserad kondrogenes och främja en antihypertrofisk mikromiljö.
Introduction
Ställningar inom vävnadsteknik spelar en viktig roll för att ge strukturellt stöd för cellfästning och efterföljande vävnadsutveckling1. Vanligtvis förlitar sig konventionella vävnadskonstruktioner utan byggnadsställningar på cellodlingsmiljön och tillsatte tillväxtfaktorer för att förmedla celldifferentiering. Dessutom är denna tillsats av bioaktiva molekyler i byggnadsställningar ofta det föredragna tillvägagångssättet för att styra celldifferentiering och funktion 2,3. Vissa byggnadsställningar kan efterlikna den biokemiska mikromiljön hos inhemska vävnader oberoende, medan andra direkt kan påverka cellfunktioner via tillväxtfaktorer. Forskare stöter dock ofta på utmaningar när de väljer ställningar som kan påverka celladhesion, tillväxt och differentiering positivt, samtidigt som de ger optimalt strukturellt stöd och stabilitet under en lång period 4,5. De bioaktiva molekylerna är ofta löst bundna till ställningen vilket leder till snabb frisättning av dessa proteiner vid implantation, vilket resulterar i att de frigörs på oönskade platser. Detta kulminerar i biverkningar på vävnader eller celler som inte avsiktligt riktades mot 6,7.
Byggnadsställningar är vanligtvis gjorda av polymera material. Janus basnanomatris (JBNm) är en biomimetisk ställningsplattform skapad med en ny lager-för-lager-metod för självhållbar broskvävnadskonstruktion8. Dessa nya DNA-inspirerade nanorör har fått namnet Janus base nanotubes (JBNts), eftersom de korrekt efterliknar strukturen och ytkemin hos kollagen som finns i den extracellulära matrisen (ECM). Med tillsats av bioaktiva molekyler, såsom matrilin-3 och Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skapa en optimal mikromiljö som sedan kan stimulera önskad cell- och vävnadsfunktionalitet9.
JBNts är nya nanorör härledda från syntetiska versioner av nukleobasadenin och tymin. JBNts bildas genom självmontering10; Sex syntetiska nukleobaser binder för att bilda en ring, och dessa ringar genomgår π-π staplingsinteraktioner för att skapa ett nanorör 200-300 μm i längd11. Dessa nanorör liknar strukturellt kollagenproteiner; genom att efterlikna en aspekt av den inhemska broskmikromiljön har JBNts visat sig ge ett gynnsamt fästställe för kondrocyter och humana mesenkymala stamceller (hMSC)11,12,13,14. Eftersom nanorören genomgår självmontering och inte kräver någon form av initiator (t.ex. UV-ljus) visar de spännande potential som en injicerbar byggnadsställning för svåråtkomliga defekta områden15.
Matrilin-3 är ett strukturellt extracellulärt matrisprotein som finns i brosk. Detta protein spelar en viktig roll i kondrogenes och korrekt broskfunktion16,17. Nyligen har det inkluderats i biomaterialställningar, vilket uppmuntrar kondrogenes utan hypertrofi 9,18,19. Genom att inkludera detta protein i JBNm lockas broskceller till en byggnadsställning som innehåller liknande komponenter som den i dess ursprungliga mikromiljö. Dessutom har det visat sig att matrilin-3 behövs för korrekt TGF-β1-signalering inom kondrocyter20. Tillväxtfaktorer fungerar som signalmolekyler, vilket orsakar specifik tillväxt av en viss cell eller vävnad. För att uppnå optimal broskregenerering är matrilin-3 och TGF-β1 väsentliga komponenter inom JBNm. Tillsatsen av TGF-β1 i lager-för-lager-ställningen kan ytterligare främja broskregenerering i en vävnadskonstruktion. TGF-β1 är en tillväxtfaktor som används för att uppmuntra läkningsprocessen av osteokondrala defekter, vilket uppmuntrar kondrocyt- och hMSC-proliferation och differentiering21,22. Således spelar TGF-β1 en nyckelroll i broskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, vilket uppmuntrar till korrekt tillväxt, särskilt när den är lokaliserad inom JBNm-lagren.
Som tidigare nämnts monteras tillväxtfaktorer vanligtvis på utsidan av byggnadsställningar utan specifika metoder för införlivande. Här, med den exakt utformade nanoarkitekturen av biomaterialen, utvecklades JBNm för specifik inriktning av avsedda celler och vävnader. JBNm består av TGF-β1 vidhäftad på JBNt-ytor i det inre skiktet och matrilin-3 vidhäftad på JBNt-ytor i det yttre skiktet24,25. Införlivandet av TGF-β1 i det inre skiktet i lager-för-lager-strukturen möjliggör en mycket lokaliserad mikromiljö längs JBNm-fibrerna, vilket skapar en homeostatisk vävnadskonstruktion med en mycket långsammare frisättning av proteinet12. Injicerbarheten hos JBNm gör den till en idealisk broskvävnadskonstruktion för olika framtida biomaterialapplikationer26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denna studie är att utveckla en biomimetisk ställningsplattform, JBNm, för att övervinna begränsningarna hos konventionella vävnadskonstruktioner som förlitar sig på cellodlingsmiljöer för att förmedla celldifferentiering. JBNm är en lager-för-lager-strukturställning för en självförsörjande broskvävnadskonstruktion. Den innovativa designen är baserad på nya DNA-inspirerade nanomaterial, JBNts. JBNm, som består av JBNts30, TGF-β1 och matrilin-3, monteras genom en n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH-bidrag 7R01AR072027 och 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 och University of Connecticut. Detta arbete stöds också delvis av NIH-bidrag S10OD016435.
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
Referências
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
- Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
- Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
- James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
- Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
- Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
- Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
- Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
- Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
- Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
- Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
- Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
- Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
- Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
- Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
- Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
- Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
- Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
- Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
- Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
- Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
- Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
- Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
- Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
- Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
- Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
- Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
- Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
- Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
- Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).
