O presente protocolo descreve um método de clareamento tecidual e coloração imunofluorescente de montagem completa para imagens renais tridimensionais (3D). Esta técnica pode oferecer perspectivas macroscópicas na patologia renal, levando a novas descobertas biológicas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Coloração tridimensional de rim inteiro com CUBIC
Neste artigo
Resumo
Resumo
Embora a patologia convencional fornecesse inúmeras informações sobre a microestrutura renal, era difícil saber a estrutura precisa dos vasos sanguíneos, túbulos proximais, ductos coletores, glomérulos e nervos simpáticos no rim devido à falta de informações tridimensionais (3D). A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse grande obstáculo. Múltiplas células em um órgão inteiro podem ser analisadas em resolução de célula única, combinando limpeza de tecido e técnica de imagem 3D. No entanto, os métodos de marcação celular para imagens de órgãos inteiros permanecem subdesenvolvidos. Em particular, a coloração de órgãos de montagem inteira é um desafio devido à dificuldade de penetração de anticorpos. O presente protocolo desenvolveu uma coloração renal de camundongo de montagem completa para imagens 3D com o método de clareamento tecidual CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). O protocolo possibilitou visualizar a denervação simpática renal após lesão de isquemia-reperfusão e glomerulomegalia no estágio inicial da doença renal diabética de um ponto de vista abrangente. Assim, esta técnica pode levar a novas descobertas na pesquisa renal, fornecendo uma perspectiva macroscópica.
Introdução
O rim é composto por várias populações celulares. Embora a patologia convencional nos dê muita informação sobre o microambiente renal, a imagem tridimensional (3D) é necessária para entender com precisão o crosstalk intercelular durante a progressão da doença renal. No passado, um grande número de cortes seriados e reconstrução de imagens precisava ser realizado para a imagem 3D de todo o órgão1. No entanto, este método exigiu muito esforço e teve problemas em termos de reprodutibilidade.
A limpeza óptica é uma boa estratégia para superar esse obstáculo 2,3. ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tóquio. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health. Camundongos machos C57BL/6NJcl, com 8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação animal e fixação renal
- Realize a fixação de perfusão seguindo os passos abaixo.
- Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (3%, 2,0 L/min) e administração intraperitoneal de cloridrato de me....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Utilizando esse método de coloração, foram visualizados nervos simpáticos [anticorpo antitirosina hidroxilase (TH)] e artérias [anticorpo anti-actina do músculo liso (αSMA) anti-α] em um rim inteiro (Figura 4A,B e Vídeo 1)9. Nervos simpáticos renais anormais também foram visualizados após lesão de isquemia/reperfusão (IRA)9,10 (Figura 4C). Além di.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O presente protocolo permitiu a imagem 3D de todo o rim de várias estruturas, como nervos simpáticos, ductos coletores, artérias, túbulos proximais e glomérulos 9,10,11. Esse método de coloração ofereceu observação macroscópica e levou a novas descobertas biológicas, visualizando a alteração dos nervos simpáticos renais após lesão de isquemia-reperfusão 9,10 e glomerulomegalia no estágio inicia.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Parte deste trabalho foi realizado através da colaboração com o Prof. Hiroki R. Ueda (Universidade de Tóquio), Prof. Etsuo A. Susaki (Universidade de Juntendo), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidade de Tohoku), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada e Dr. Hirotaka Komaba (Universidade de Tokai).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 14 mL Tubo de ensaio PP de alta clareza | Falcon | 352059 | Limpeza de tecidos, coloração, lavagem |
| 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona / antipirina | Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R + |
| 37%-Formaldeído Solução | Nacalai Tesque | 16223-55 | Pós-fixação |
| 4%-Paraformaldeído Solução Tampão de Fosfato | Nacalai Tesque | 09154-85 | Fixação renal |
| Alexa Flour 555 anticorpo IgG anti-ovelha conjugado para burro | Invitrogen | A-21436 | Anticorpo secundário (1:100) |
| Alexa Flour 647 anticorpo IgG anti-coelho conjugado para burro | Invitrogen | A-31573 | Anticorpo secundário (1:200) |
| Anticorpo anti-aquaporina 2 (AQP2) | Abcam | ab199975 | Anticorpo primário (1:100) |
| Anticorpo anti-podocina | Sigma-Aldrich | P0372 | Anticorpo primário (1:100) |
| Anticorpo anti-cotransportador de glicose sódica 2 (SGLT2) | Abcam | ab85626 | Anticorpo primário (1:100) |
| Anticorpo antitirosina hidroxilase (TH) | Abcam | ab113 | Anticorpo primário (1:100) |
| Anticorpo anti-&alfa;-actina de músculo liso (α-SMA) | Abcam | ab5694 | Anticorpo primário (1:200) |
| Bloqueador de caseína em PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Tampão de coloração |
| Butorfanol Tartarato | Meiji | 005526 | Anestésico |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Cepa de camundongo |
| Imaris | Bitplane | N/A | Software de análise de imagem |
| Microscópio de macro-zoom | OLYMPUS | MVX10 | A unidade de observação do microscópio feito sob medida |
| Cloridrato de medetomidina | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | anestésico |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anestésico |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M8410 | Óleo de imersão |
| N-butiledietanolamina | Tokyo Indústria Química | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R + |
| Nicotinamida | Tokyo Indústria química | N0078 | CUBIC-R + |
| Polietilenoglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Óleo de silício HIVAC-F4 | Shin-Etsu Óleo químico | 50449832 | imersão |
| Azida de sódio | Wako | 195-11092 | Tampão de coloração |
Referências
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
