परंपरागत रूप से, सेल संस्कृति प्लानर सब्सट्रेट पर की जाती है जो विवो में कोशिकाओं के प्राकृतिक वातावरण की खराब नकल करती है। यहां हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक घुमावदार ज्यामिति और माइक्रोपैटर्न्ड बाह्य प्रोटीन के साथ सेल संस्कृति सब्सट्रेट का उत्पादन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिससे इन बाह्य संकेतों के सेलुलर संवेदन में व्यवस्थित जांच की अनुमति मिलती है।
बाह्य मैट्रिक्स सेल फ़ंक्शन का एक महत्वपूर्ण नियामक है। सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट में मौजूद पर्यावरणीय संकेत, जैसे कि लिगैंड वितरण और ऊतक ज्यामिति, सेल फेनोटाइप और व्यवहार को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए तेजी से दिखाए गए हैं। हालांकि, इन पर्यावरणीय संकेतों और कोशिकाओं पर उनके प्रभावों का अक्सर इन विट्रो प्लेटफार्मों का उपयोग करके अलग से अध्ययन किया जाता है जो व्यक्तिगत संकेतों को अलग करते हैं, एक रणनीति जो कई संकेतों की विवो स्थिति में जटिल को भारी रूप से सरल बनाती है। इंजीनियरिंग दृष्टिकोण इस अंतर को पाटने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकते हैं, प्रयोगात्मक सेटअप विकसित करके जो इन विवो माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को पकड़ते हैं, फिर भी इन विट्रो सिस्टम की सटीकता और मैनिपुलेबिलिटी की डिग्री को बनाए रखते हैं।
यह अध्ययन पराबैंगनी (यूवी) आधारित प्रोटीन पैटर्निंग और लिथोग्राफी-आधारित सब्सट्रेट माइक्रोफैब्रिकेशन के संयोजन के दृष्टिकोण पर प्रकाश डालता है, जो एक साथ बहु-प्रवाह वातावरण में सेल व्यवहार में उच्च-थ्रूपुट जांच को सक्षम करता है। मास्कलेस यूवी-फोटोपैटर्निंग के माध्यम से, चिप्स पर त्रि-आयामी (3 डी) सेल संस्कृति सब्सट्रेट पर जटिल, चिपकने वाला प्रोटीन वितरण बनाना संभव है जिसमें विभिन्न प्रकार के अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामितीय संकेत होते हैं। प्रस्तावित तकनीक को विभिन्न बहुलक सामग्रियों से बने संस्कृति सब्सट्रेट के लिए नियोजित किया जा सकता है और प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के चिपकने वाले पैटर्न वाले क्षेत्रों के साथ जोड़ा जा सकता है। इस दृष्टिकोण के साथ, एकल कोशिकाओं, साथ ही मोनोलेयर, पैटर्न वाले सब्सट्रेट द्वारा प्रस्तुत ज्यामितीय संकेतों और संपर्क मार्गदर्शन संकेतों के संयोजन के अधीन किया जा सकता है। चिप सामग्री, प्रोटीन पैटर्न और सेल प्रकारों के संयोजन का उपयोग करके व्यवस्थित अनुसंधान इस प्रकार बहुउपस्थित्व के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
विवो में, कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार के पर्यावरणीय संकेतों के अधीन किया जाता है जो यांत्रिक, भौतिक और जैव रासायनिक प्रकृति के हो सकते हैं जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से उत्पन्न होते हैं। सेल व्यवहार के विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए कई पर्यावरणीय संकेतों की पहचान की गई है, जैसे प्रसार, भेदभाव और प्रवासन 1,2,3,4,5। सबसे व्यापक रूप से जांच की गई घटनाओं में से एक संपर्क मार्गदर्शन है, जो बाह्य सब्सट्रेट 6,7,8,9,10,11 पर मौजूद अनिसोट्रोपिक जैव रासायनिक या स्थलाकृतिक पैटर्न के साथ आसंजन-मध्यस्थता सेल संरेखण का वर्णन करता है। कोशिकाओं के संरेखण को निर्देशित करने से परे, संपर्क मार्गदर्शन संकेतों को अन्य सेल गुणों जैसे सेल माइग्रेशन, इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के संगठन, सेल आकार और सेल भाग्य12,13,14,15 को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, 3 डी सेलुलर पर्यावरण की ज्यामितीय वास्तुकला को सेल व्यवहार16,17 पर इसके नियामक प्रभाव के लिए भी स्वीकार किया गया है। मानव शरीर में, कोशिकाओं को माइक्रोस्केल कोलेजन फाइबर, केशिकाओं और ग्लोमेरुली से लेकर मेसोस्केल एल्वियोली और धमनियों18,19 तक घुमावदार ज्यामिति की एक श्रृंखला के संपर्क में लाया जाता है। दिलचस्प बात यह है कि हाल के इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाएं नैनो से मेसोस्केल20,21,22,23 तक ऐसे भौतिक संकेतों को समझ सकती हैं और प्रतिक्रिया दे सकती हैं।
आज तक, पर्यावरणीय संकेतों के लिए सेल प्रतिक्रिया की जांच करने वाले अधिकांश अध्ययन बड़े पैमाने पर प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके किए गए हैं जो एकल संकेतों को अलग करते हैं। हालांकि इस दृष्टिकोण ने पर्यावरणीय संकेतों के सेलुलर संवेदन के पीछे बुनियादी तंत्र को समझने में जबरदस्त प्रगति की अनुमति दी है, यह विवो पर्यावरण में खराब रूप से पुनरावृत्ति करता है जो एक साथ कई संकेत प्रस्तुत करता है। इस अंतर को पाटने के लिए, संस्कृति प्लेटफार्मों को विकसित करना उपयोगी है जिससे कई पर्यावरणीय संकेतों को स्वतंत्र रूप से और एक साथ नियंत्रित किया जा सकता है। मैट्रिक्स कठोरता और लिगैंड घनत्व 26,27,28,29, सब्सट्रेट कठोरता और सरंध्रता 30, सब्सट्रेट कठोरता और 3 डी माइक्रोनिच वॉल्यूम 31, सतह स्थलाकृति और संपर्क-मार्गदर्शन संकेत 32,33,34 के संयोजन के साथ इस अवधारणा ने हाल ही में 24,25 बढ़ते कर्षण प्राप्त किए हैं , और मेसोस्केल वक्रता मार्गदर्शन संकेतों के साथ नैनोस्केल संपर्क-मार्गदर्शन संकेत23. हालांकि, नियंत्रित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से विभिन्न प्रकार के 3 डी ज्यामिति के साथ संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों को संयोजित करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है।
यह शोध प्रोटोकॉल इस चुनौती को संबोधित करता है और ईसीएम प्रोटीन (संपर्क-मार्गदर्शन संकेत) और सब्सट्रेट वक्रता (ज्यामितीय संकेत) के पैटर्न वाले चिपकने वाले क्षेत्रों के नियंत्रित संयोजन के साथ सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के लिए एक विधि का परिचय देता है। यह दृष्टिकोण एक व्यवस्थित और उच्च थ्रूपुट तरीके से बायोमिमेटिक मल्टीक्यू वातावरण में सेल प्रतिक्रिया के विच्छेदन की अनुमति देता है। प्राप्त ज्ञान जटिल वातावरण में सेल व्यवहार की आगे की समझ में सहायता कर सकता है और इसका उपयोग उन गुणों के साथ शिक्षाप्रद सामग्रियों को डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है जो सेल प्रतिक्रियाओं को वांछित परिणाम में चलाते हैं।
3 डी प्रोटीन फोटोपैटर्निंग
सेल संस्कृति सामग्री पर ईसीएम प्रोटीन (संपर्क-मार्गदर्शन संकेत) के चिपकने वाले क्षेत्रों का निर्माण विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, गहरे पराबैंगनी (गहरे-यूवी) पैटर्निंग या माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग35,36 द्वारा। डीप-यूवी पैटर्निंग यूवी-लाइट का उपयोग करता है जिसे सेल कल्चर सब्सट्रेट पर विशिष्ट स्थानों पर निष्क्रिय पॉलिमर को नीचा दिखाने के लिए बहुलक सामग्री पर एक मुखौटा के माध्यम से अनुमानित किया जाता है। पैटर्न वाले सब्सट्रेट को तब ब्याज के लिगैंड के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप चिपकने वाले क्षेत्र होते हैं जो पूर्वनिर्धारित स्थानों 12,37,38 पर सेल लगाव और संस्कृति का समर्थन करते हैं। प्रोटीन पैटर्न को पेश करने का एक वैकल्पिक तरीका माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के माध्यम से है, जहां वांछित आकार वाले इलास्टोमेरिक टिकटों को पसंद के प्रोटीन के साथ लेपित किया जाता है और सेल कल्चर सब्सट्रेट पर दबाया जाता है, जिससे प्रोटीन कोटिंग को स्थानांतरित किया जाता है जिसमें कोशिकाएं 35,37,39,40 का पालन कर सकती हैं . दुर्भाग्य से, चूंकि दोनों तकनीकें मुखौटा तैयारी और नरम लिथोग्राफी विधियों पर भरोसा करती हैं, इसलिए प्रयोग समय लेने वाली और श्रम-गहन हैं, साथ ही पैटर्न लचीलेपन के मामले में सीमित हैं। इसके अलावा, डीप-यूवी पैटर्निंग और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग दोनों प्लानर सामग्रियों के लिए सबसे उपयुक्त हैं और तकनीकी रूप से कठिन हैं, यदि असंभव नहीं है, तो 3 डी वातावरण में लिगेंड को पैटर्न करने के लिए।
इन पारंपरिक तरीकों में सुधार करने के लिए, वाटरकोट एट अल संयुक्त मास्कलेस लिथोग्राफी, रासायनिक वाष्प जमाव, और थर्मोफॉर्मिंग माइक्रोपैटर्न 3 डी पॉलिमरिक सब्सट्रेट41 उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, यह तकनीक थर्मोफॉर्मेबल बहुलक फिल्मों के उपयोग पर निर्भर करती है और कम प्रोटीन-पैटर्न रिज़ॉल्यूशन (7.5 μm) प्रदान करती है, जबकि कोशिकाओं को ज्यामितीय प्रोटीन पैटर्न का जवाब देने के लिए 0.1 μm2,42 के रूप में छोटे होने की सूचना दी गई है। सेवसिक एट अल नैनो- और माइक्रोमीटर टोपोग्राफी वाले सब्सट्रेट पर नैनोपैटर्न ईसीएम लिगेंड के लिए एक और आशाजनक विधिका वर्णन किया 43. माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग का उपयोग करते हुए, ईसीएम प्रोटीन को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) टिकटों से थर्मोरेस्पॉन्सिव पॉली (एन-आइसोप्रोपाइलाक्रिलामाइड) (पीएनआईपीएएम) सब्सट्रेट में स्थानांतरित किया गया था। इसके बाद, पीएनआईपीएएम नेटवर्क की थर्मोरेस्पॉन्सिव संपत्ति ने उन्हें स्थलाकृतिक पीडीएमएस सब्सट्रेट (10-100 μm गहरे खांचे) में द्वि-आयामी (2 डी) प्रोटीन पैटर्न को स्थानांतरित करने की अनुमति दी, जिससे स्थलाकृतिक विशेषताओं पर आसंजन साइटों के स्थानीयकरण को नियंत्रित किया जा सके। हालांकि, सभी संभव माइक्रोटोपोग्राफी को पैटर्न नहीं किया जा सकता है क्योंकि गीलेपन के मुद्दों में कमी से गहरे स्थलाकृतिक सब्सट्रेट को पैटर्न करना अधिक कठिन हो जाता है। 2.4 की गहराई से चौड़ाई पहलू अनुपात के साथ खाइयों को स्थलाकृतिक सब्सट्रेट43 में पैटर्न को सफलतापूर्वक स्थानांतरित करने की अंतिम सीमा होने की सूचना दी गई है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग की आवश्यकता के कारण अलग-अलग पैटर्न का लचीलापन और उत्पन्न पैटर्न का रिज़ॉल्यूशन खराब है।
यह पेपर एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो उपर्युक्त बाधाओं को दूर करता है और मल्टीक्यू सब्सट्रेट बनाने के लिए एक लचीली और उच्च-थ्रूपुट विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग सेल संस्कृति के लिए किया जा सकता है ( चित्र 1 देखें)। शारीरिक रूप से प्रासंगिक ज्यामिति (सिलेंडर, गुंबद, दीर्घवृत्त, और काठी सतहों) से लेकर वक्रता के साथ ऽ = 1/2500 से ॐ = 1/125 μm-1 पीडीएमएस चिप्स में पूर्व-डिज़ाइन और माइक्रोफैब्रिकेटेड हैं। इसके बाद, संपर्क-मार्गदर्शन संकेत 1.5 μm44 के रूप में छोटे रिज़ॉल्यूशन के साथ एक फोटोपैटर्निंग तकनीक को नियोजित करके विभिन्न डिजिटल पैटर्न डिज़ाइनों का उपयोग करके 3 डी ज्यामिति के शीर्ष पर बनाए जाते हैं। यह अंत करने के लिए, पीडीएमएस चिप्स शुरू में कोशिकाओं और प्रोटीन का पालन करने से रोकने के लिए निष्क्रिय कर रहे हैं; इस निष्क्रियता परत को तब फोटोइनिशिएटर 4-बेंज़ोयलबेंजाइल-ट्राइमेथिलामोनियम क्लोराइड (पीएलपीपी) और यूवी-लाइट एक्सपोजर45 के संयोजन से हटाया जा सकता है। एक डिजिटल मास्क को यूवी-एक्सपोजर के स्थानों को निर्दिष्ट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और इस प्रकार, वह क्षेत्र जहां निष्क्रियता परत को हटा दिया जाता है। प्रोटीन बाद में इन क्षेत्रों का पालन कर सकते हैं, जिससे कोशिका लगाव सक्षम हो सकता है। चूंकि पैटर्निंग एक डिजिटल (भौतिक के बजाय) मास्क का उपयोग करके किया जाता है, इसलिए अतिरिक्त फोटोमास्क को डिजाइन करने और बनाने से जुड़ी परेशानी और लागत के बिना विभिन्न प्रकार के पैटर्न जल्दी से बनाए जा सकते हैं। इसके अलावा, ईसीएम प्रोटीन की एक विविध श्रृंखला (जैसे, कोलेजन प्रकार मैं, जिलेटिन, और फाइब्रोनेक्टिन) सब्सट्रेट पर पैटर्न किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल पीडीएमएस से बने सेल संस्कृति चिप्स का उपयोग करके किया जाता है, सिद्धांत को ब्याज की किसी भी अन्य सामग्री पर लागू किया जा सकताहै 46.
आजकल, सेल व्यवहार का अध्ययन अक्सर फ्लैट संस्कृति सब्सट्रेट पर किया जाता है जिसमें देशी सेल माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता की कमी होती है। मचान और हाइड्रोगेल जैसे 3 डी वातावरण का उपयोग विकल्प के रूप में किया जाता है। यद्यपि ये सेल संस्कृति वातावरण विवो प्रासंगिकता में सुधार करते हैं, सेल व्यवहार के व्यवस्थित अध्ययन और रीडआउट विधियों की व्यवहार्यता दोनों चुनौतीपूर्ण रहते हैं। प्रतिनिधि संस्कृति सब्सट्रेट पर सेल व्यवहार की व्यवस्थित रूप से जांच करने के लिए, सूक्ष्म रीडआउट की अनुमति देने वाले लगातार मल्टीक्यू सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक ज्यामिति और पैटर्न वाले ईसीएम प्रोटीन के साथ मल्टीक्यू सेल संस्कृति सब्सट्रेट बनाने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इन विट्रो प्लेटफार्मों पर ऊतक ज्यामिति और संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों जैसे पर्यावरणीय संकेतों के संयोजन में मुख्य चुनौती काफी हद तक तकनीकी प्रकृति की है। सेल संस्कृति सामग्री के लिए संपर्क-मार्गदर्शन संकेतों (जैसे, नरम लिथोग्राफी, डीप-यूवी पैटर्निंग और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग35,36) को लागू करने के पारंपरिक तरीकों को प्लानर सब्सट्रेट के लिए अनुकूलित किया गया है। संपर्क मार्गदर्शन संकेतों के साथ संयुक्त 3 डी सेल संस्कृति सामग्री की आवश्यकता ने कई तकनीकी चुनौतियों पर प्रकाश डाला, जैसे कि खराब पैटर्न संरेखण, संकल्प और लचीलापन। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट, मास्कलेस, प्रकाश-आधारित पैटर्निंग विधि का उपयोग45,49 किया जा सकता है। यहां, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप सटीक पैटर्न संरेखण और माइक्रोमीटर के क्रम में एक संकल्प को सक्षम बनाता है (चित्रा 6 देखें)। इसके अलावा, डिजिटल मास्क का उपयोग शोधकर्ताओं को श्रम-गहन भौतिक मास्क बनाने की आवश्यकता के बिना पैटर्न की एक विस्तृत श्रृंखला पर सेल व्यवहार का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।
यूवी-फोटोपैटर्निंग दृष्टिकोण का उपयोग विभिन्न प्रकार की 3 डी ज्यामिति (जैसे, सिलेंडर, काठी, गुंबद, गड्ढे) के साथ संयोजन में किया जा सकता है जो सामग्री48 की एक श्रृंखला से उत्पादित होता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 3 डी सेल संस्कृति सब्सट्रेट पीडीएमएस से बने होते हैं; हालाँकि, अन्य सामग्रियों का भी उपयोग किया जा सकता है। ब्याज की विशेषताओं वाले अंतिम सेल संस्कृति सब्सट्रेट का उत्पादन करने के लिए इसके लिए विभिन्न चरणों की आवश्यकता हो सकती है। चूंकि कोशिकाओं को सेल संस्कृति सामग्री की सतह खुरदरापन के प्रति संवेदनशील दिखाया गया है, इसलिए एक चिकनी सतह के साथ सेल संस्कृति चिप्स बनाना महत्वपूर्ण है ताकि मनाया कोशिकाओं की प्रतिक्रिया पूरी तरह से 3 डी ज्यामिति और संपर्क-मार्गदर्शनसंकेत50,51 के लिए जिम्मेदार हो सके। सतह खुरदरापन को मापने के लिए ऑप्टिकल प्रोफिलोमेट्री, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जैसे माप विधियों का उपयोग किया जा सकता है। सेल संस्कृति सामग्री के निर्माण के बाद, कोई ब्याज की सुविधा के विशिष्ट आयामों पर निर्भर एक या कई फोकल विमानों के आधार पर एक पैटर्निंग विधि का चयन कर सकता है (चित्रा 3 देखें)। आमतौर पर, एक एकल फोकल विमान का उपयोग लगभग 50 μm की Z-सीमा के भीतर एक क्षेत्र को पैटर्न करने के लिए किया जाता है। पैटर्न रिज़ॉल्यूशन को अंगूठे के इस नियम का उपयोग करके सुसंगत दिखाया गया था (चित्रा 6 देखें)। हालांकि, इस पद्धति का एक नकारात्मक पक्ष कई फोकल विमानों और पैटर्न की शुरूआत के साथ बढ़ा हुआ पैटर्निंग समय है। हमारे हाथ में, कई फोकल विमानों का उपयोग करते हुए, 16 मिमी x 16 मिमी x 0.17 मिमी (एक्स एक्स वाई एक्स जेड) तक 3 डी ज्यामितीय विशेषताओं को उच्च पैटर्न गुणवत्ता के साथ सफलतापूर्वक पैटर्न किया गया है।
इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि ज्यामितीय विशेषताओं की ऊंचाई (जेड-अक्ष) जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में किया जा सकता है, सीमित है। चूंकि यूवी-फोटोपैटर्निंग और कई सेलुलर रीडआउट दोनों माइक्रोस्कोपी सेटअप पर भरोसा करते हैं, इसलिए उद्देश्यों की कामकाजी दूरी एक सुविधा की अधिकतम ऊंचाई निर्धारित करती है। हमारे हाथ में, 300 μm की ऊंचाई से अधिक ज्यामिति अभी भी यूवी-फोटोपैटर्न की जा सकती है, और रीडआउट 40x उद्देश्यों के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया है। इस प्रकार, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर से सेलुलर और ऊतक तराजू तक मैकेनोबायोलॉजिकल अनुसंधान संभव है।
एक अन्य कारक जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए, यूवी-फोटोपैटर्निंग49 के दौरान या बाद में नमूनों के सूखने का जोखिम है। 3 डी ज्यामिति का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि उत्तल अक्सर सेल संस्कृति सामग्री के बाहर उजागर होते हैं। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, इसके परिणामस्वरूप ब्याज की विशेषता के शीर्ष पर बनने वाले प्रोटीन समुच्चय के साथ असमान पैटर्न हो सकते हैं। प्रोटीन इनक्यूबेशन के बाद और सेल संस्कृति के दौरान सेल संस्कृति चिप्स की धुलाई 3 डी ज्यामिति की उचित कोटिंग के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, सेल संस्कृति चिप के शीर्ष पर हमेशा एक कामकाजी समाधान (पीबीएस, पीएलपीपी, प्रोटीन समाधान, सेल संस्कृति माध्यम) की छोटी मात्रा छोड़ने की सलाह दी जाती है।
अब तक, कई प्रोटीन कोटिंग्स (फाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन प्रकार I और IV, जिलेटिन, एफएनसी) और सेल प्रकार (मानव अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाएं, मानव मायोफिब्रोब्लास्ट, मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं, मानव केराटोसाइट्स और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट) संरचित सेल संस्कृति सामग्री पर वर्णित फोटोपैटर्निंग दृष्टिकोण के संयोजन में उपयोग किए गए हैं। जैसा कि पिछले अध्ययन48 में दिखाया गया है, प्रोटीन इनक्यूबेशन मापदंडों का अनुकूलन नए सेल प्रकारों में व्यवस्थित जांच के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, नए प्रोटीन या कोशिकाओं के साथ एक नया प्रयोग करने से पहले, प्रोटीन सांद्रता, इनक्यूबेशन तापमान और इनक्यूबेशन समय की एक श्रृंखला का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। ‘सामान्य’ सेल संस्कृति स्थितियों के तहत सेल आकृति विज्ञान के साथ सजातीय, पैटर्न वाले फ्लैट क्षेत्रों पर प्रारंभिक आसंजन के बाद सेल आकृति विज्ञान की तुलना करके, प्रयोगात्मक मापदंडों का एक अनुकूलित सेट प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक सेल प्रकार को एक विशिष्ट मल्टीक्यू वातावरण पर एक पहचानने योग्य आसंजन आकृति विज्ञान दिखाने के लिए बोने के बाद अलग-अलग समय की आवश्यकता हो सकती है ( चित्रा 5 देखें)। यह अंत करने के लिए, चरण 8.4 में धोने के दौरान पैटर्न वाले क्षेत्र पर संपर्क घटनाओं को प्रस्तुत करने के लिए प्रति सेल प्रकार आवश्यक समय का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, हमने देखा कि लाइन पैटर्न पर, मानव केराटोसाइट्स बोने के बाद पहले 30 मिनट के भीतर लम्बी आकृति विज्ञान दिखाते हैं, जबकि एंडोथेलियल कोशिकाओं और त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स को आसंजन आकृति विज्ञान में बदलाव दिखाने से पहले कई घंटों की आवश्यकता होती है। प्रोटीन इनक्यूबेशन (चरण 7) और सेल सीडिंग (चरण 8) के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक पैरामीटर इस प्रकार प्रोटीन और सेल प्रकार की पसंद पर निर्भर हो सकते हैं।
3 डी ज्यामिति पर संपर्क मार्गदर्शन संकेतों को लागू करने के लिए प्रस्तुत दृष्टिकोण जटिल मल्टीक्यू वातावरण में सेल व्यवहार की गहरी समझ बनाने में सहायता कर सकता है। इसमें इंट्रासेल्युलर घटकों, जैसे फोकल आसंजन और नाभिक में जांच शामिल हो सकती है, और प्रस्तावित विधि का उपयोग करके एक बड़े, सेल या ऊतक पैमाने पर किए गए प्रयोगों को भी शामिल किया जा सकता है। आखिरकार, यह अनुमान लगाया जाता है कि प्राप्त ज्ञान का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के डिजाइन में किया जा सकता है, जहां जटिल सेलुलर वातावरण को वांछित परिणाम की ओर सेल व्यवहार को चलाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
The authors have nothing to disclose.
हम मानव प्राथमिक केराटोसाइट्स प्रदान करने के लिए डॉ नेलो फॉर्मिसानो (एमईआरएलएन इंस्टीट्यूट फॉर टेक्नोलॉजी-इंस्पायर्ड रीजनरेटिव मेडिसिन) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को केमेलोट इनसाइट (प्रोजेक्ट बीएम 3.02) द्वारा समर्थित किया गया है; यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान 851960); और गुरुत्वाकर्षण कार्यक्रम 024.003.013 “सामग्री संचालित उत्थान” के लिए शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान मंत्रालय। लेखक अपने पत्राचार, सहायता और समस्या निवारण के लिए अल्वेल को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |