伝統的に、細胞培養は、 インビボで細胞の自然環境をほとんど模倣しない平面基質上で行われる。ここでは、生理学的に関連する湾曲した形状およびマイクロパターン化された細胞外タンパク質を有する細胞培養基質を作製し、これらの細胞外手がかりの細胞センシングを系統的に調査する方法について説明する。
細胞外マトリックスは、細胞機能の重要な調節因子である。リガンド分布や組織形状などの細胞微小環境に存在する環境手がかりは、細胞表現型および挙動を支配する上で重要な役割を果たすことがますます示されている。しかし、これらの環境手がかりと細胞に対するそれらの影響は、多くの場合、個々の手がかりを分離するin vitro プラットフォームを使用して別々に研究され、複数の手がかりの複雑な in vivo 状況を大幅に単純化する戦略です。エンジニアリングアプローチは、 in vivo 微小環境の複雑さを捉えながら、in vitro システムの精度と操作可能性の程度を保持する実験セットアップを開発することによって、このギャップを埋めるために特に有用であり得る。
この研究は、紫外線(UV)ベースのタンパク質パターニングとリソグラフィーベースの基板微細加工を組み合わせたアプローチを強調しており、マルチキュー環境における細胞挙動のハイスループット調査を可能にします。マスクレスUVフォトパターニングにより、さまざまな明確に定義された幾何学的手がかりを含むチップ上の3次元(3D)細胞培養基板上に複雑で接着性タンパク質分布を作成することが可能です。提案された技術は、異なるポリマー材料から作られ、広範囲のタンパク質の接着パターン化された領域と組み合わせた培養基材に採用することができる。このアプローチにより、単一細胞は、単層と同様に、パターン化された基板によって提示される幾何学的手がかりおよび接触誘導手がかりの組み合わせを受けることができる。したがって、チップ材料、タンパク質パターン、および細胞型の組み合わせを用いた体系的な研究は、マルチキュー環境に対する細胞応答に関する基本的な洞察を提供することができる。
インビボでは、細胞は、細胞外マトリックス(ECM)に由来する機械的、物理的、および生化学的性質のものであり得る多種多様な環境手がかりを受ける。増殖、分化、遊走などの細胞行動の調節に重要な役割を果たしている多数の環境手がかりが同定されている1,2,3,4,5。最も広く調査された現象の1つは接触ガイダンスであり、細胞外基板6、7、8、9、10、11上に存在する異方性生化学的または地形学的パターンに沿った接着媒介性細胞アライメントを記述する。細胞のアライメントを指示するだけでなく、接触ガイダンスの手がかりは、細胞遊走、細胞内タンパク質の組織化、細胞形状、および細胞運命などの他の細胞特性にも影響を与えることが示されている12、13、14、15。さらに、3Dセルラー環境の幾何学的アーキテクチャは、セル挙動に対するその調節的影響についても認められている16,17。人体では、細胞はマイクロスケールのコラーゲン線維、毛細血管、糸球体からメソスケールの肺胞や動脈まで、さまざまな湾曲した形状にさらされています18,19。興味深いことに、最近のインビトロ研究は、細胞がナノスケールからメソスケールまで、そのような物理的手がかりを感知し、応答することができることを示している20、21、22、23。
今日まで、環境手がかりに対する細胞応答を調査するほとんどの研究は、単一の手がかりを分離する実験セットアップを使用して主に行われてきた。このアプローチは、環境手がかりの細胞センシングの背後にある基本的なメカニズムの理解において驚異的な進歩を可能にしましたが、複数の手がかりを同時に提示するin vivo環境をほとんど再現していません。このギャップを埋めるには、複数の環境手がかりを独立して同時に制御できる文化プラットフォームを開発することが有用です。この概念は、マトリックス剛性と配位子密度26,27,28,29、基板剛性と気孔率30、基板剛性と3Dマイクロニッチ体積31、表面地形と接触誘導手がかり32,33,34を組み合わせた研究により、最近24,25の牽引力を高めています。、およびメソスケール曲率ガイダンスキュー23を有するナノスケール接触ガイダンスキュー。しかし、接触誘導の手がかりをさまざまな3D形状と制御された高スループットの方法で組み合わせることは依然として困難です。
この研究プロトコルは、この課題に対処し、ECMタンパク質のパターン化された接着領域(接触誘導手がかり)と基質曲率(幾何学的手がかり)の制御された組み合わせを有する細胞培養基質を作成する方法を導入する。このアプローチは、生物模倣マルチキュー環境における細胞応答の解剖を、体系的かつハイスループットな方法で可能にする。得られた知識は、複雑な環境における細胞挙動のさらなる理解に役立ち、細胞応答を所望の結果に導く特性を有する有益な材料を設計するために使用することができる。
3Dタンパク質フォトパターニング
細胞培養材料上のECMタンパク質の接着領域(接触誘導手がかり)の作成は、例えば、深紫外(deep-UV)パターニングまたはマイクロコンタクト印刷によって、様々な技術を用いて達成することができる35、36。ディープUVパターニングは、ポリマー材料上のマスクを介して投影されるUV光を利用して、細胞培養基板上の特定の位置で不動態化ポリマーを分解する。次いで、パターン化された基板を、目的のリガンドと共にインキュベートし、予め定義された位置12、37、38上で細胞付着および培養を支持する接着領域をもたらす。タンパク質パターンを導入する別の方法は、マイクロコンタクト印刷によるものであり、所望の形状を含むエラストマースタンプを任意のタンパク質でコーティングし、細胞培養基材上にプレスし、それによって細胞が接着できるタンパク質コーティングを転写する35,37,39,40.残念ながら、どちらの手法もマスク調製法とソフトリソグラフィー法に依存しているため、実験には時間と労力がかかり、パターンの柔軟性の点では限られています。さらに、深紫外パターニングとマイクロコンタクト印刷はどちらも平面材料に最も適しており、3D環境での配位子のパターニングには不可能ではないにしても技術的に困難です。
これらの従来の方法を改善するために、Waterkotteらは、マスクレスリソグラフィー、化学気相成長、および熱成形を組み合わせて、マイクロパターン化された3Dポリマー基板41を生成する。しかし、この技術は熱成形可能なポリマーフィルムの使用に依存しており、低いタンパク質パターン分解能(7.5μm)を提供し、細胞は0.1μm2,42という小さな幾何学的タンパク質パターンに応答することが報告されている。Sevcikらは、ナノおよびマイクロメートルの地形図を含む基板上のECMリガンドをナノパターン化する別の有望な方法を記載した43。マイクロコンタクト印刷を用いて、ECMタンパク質をポリジメチルシロキサン(PDMS)スタンプから温度応答性ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(pNIPAM)基板に転写した。その後、pNIPAMネットワークの温度応答性により、2次元(2D)タンパク質パターンを地形PDMS基板(10-100μmの深溝)に転写することができ、それによって地形学的特徴上の接着部位の局在を制御することができた。しかし、濡れ性の低下の問題により、より深い地形基板をパターン化することがより困難になるため、すべての可能なマイクロトポグラフィーをパターン化できるわけではありません。深さ対幅アスペクト比が2.4のトレンチは、地形基板43にパターンを首尾よく転写するための究極の限界であると報告されている。さらに、さまざまなパターンの柔軟性と生成されたパターンの解像度は、マイクロコンタクト印刷の要件のために貧弱です。
本稿では、上記のボトルネックを克服し、細胞培養に使用できるマルチキュー基質を作成するための柔軟でハイスループットな方法を提示する方法について説明します( 図1参照)。曲率が ĸ = 1/2500 ~ ĸ = 1/125 μm-1 の範囲の生理学的に関連する形状(シリンダー、ドーム、楕円、およびサドル表面)は、PDMSチップで事前に設計および微細加工されています。その後、1.5μm44という小さな解像度のフォトパターニング技術を採用することにより、さまざまなデジタルパターン設計を使用して、3Dジオメトリの上に接触誘導キューが作成されます。この目的のために、PDMSチップは、細胞およびタンパク質が接着するのを防ぐために最初に不動態化される。次いで、このパッシベーション層は、光開始剤4−ベンゾイルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド(PLPP)およびUV光露光45の組み合わせによって除去することができる。デジタルマスクは、UV露光の位置、つまりパッシベーション層が除去される領域を指定するように設計されています。タンパク質はその後、これらの領域に接着することができ、細胞付着を可能にする。パターニングは(物理的なマスクではなく)デジタルマスクを使用して実行されるため、追加のフォトマスクの設計と製造に関連する手間とコストをかけずに、さまざまなパターンをすばやく作成できます。さらに、多様な範囲のECMタンパク質(例えば、コラーゲンタイプI、ゼラチン、およびフィブロネクチン)を基板上にパターニングすることができる。このプロトコルはPDMSで作製された細胞培養チップを用いて行われるが、この原理は、関心のある任意の他の材料に適用することができる46。
今日、細胞挙動は、天然の細胞微小環境の複雑さを欠いている平坦な培養基質上でしばしば研究される。足場やヒドロゲルなどの3D環境が代替として使用されます。これらの細胞培養環境はin vivoでの関連性を向上させるが、細胞挙動の体系的な研究と読み出し方法の実現可能性の両方は依然として課題である。代表的な培養基質上の細胞挙動を体系的に調査するには、顕微鏡的な読み出しを可能にする一貫したマルチキュー基質が必要です。したがって、このプロトコルでは、生理学的に関連する形状およびパターン化されたECMタンパク質を有するマルチキュー細胞培養基質を作成する方法を記載する。in vitroプラットフォーム上で組織形状や接触誘導キューなどの環境キューを組み合わせる際の主な課題は、主に技術的な性質のものです。接触誘導手がかり(例えば、ソフトリソグラフィー、深紫外パターニング、およびマイクロコンタクトプリンティング35,36)を細胞培養材料に適用する従来の方法は、平面基板用に最適化されてきた。接触ガイダンスの手がかりと組み合わせた3D細胞培養材料の必要性は、パターンアライメントの貧弱さ、解像度、柔軟性など、いくつかの技術的課題を強調しました。これらの課題を克服するために、高スループット、マスクレス、光ベースのパターニング方法を使用することができる45,49。ここで、光学顕微鏡は、正確なパターンアライメントとマイクロメートルオーダーの分解能を可能にします(図6参照)。さらに、デジタルマスクを使用することで、研究者は労働集約的な物理マスクを製造することなく、幅広いパターンで細胞の挙動を研究することができます。
UVフォトパターニングアプローチは、様々な材料48から生成される様々な3D形状(例えば、シリンダー、サドル、ドーム、ピット)と組み合わせて使用することができる。この研究で使用した3D細胞培養基質はPDMSから作られています。ただし、他の材料も使用できます。これは、目的の特徴を含む最終的な細胞培養基材を製造するために異なるステップを必要とするかもしれない。細胞は細胞培養材料の表面粗さに敏感であることが示されているので、観察された細胞の応答が3D幾何学的および接触誘導手がかりに完全に起因するように、滑らかな表面を有する細胞培養チップを作成することが重要です50,51。表面粗さの測定には、光学プロフィロメトリー、走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などの測定方法を使用できます。細胞培養材料の作製後、関心のある特徴の特定の寸法に依存する1つまたは複数の焦点面に基づくパターニング方法を選択することができる(図3参照)。通常、単一焦点面を使用して、約50μmのZ範囲内の領域をパターン化します。この経験則を使用して、パターン解決に一貫性があることが示されました(図6参照)。しかし、この方法の欠点は、複数の焦点面とパターンの導入によりパターニング時間が長くなることです。私たちの手では、複数の焦点面を使用して、最大16 mm x 16 mm x 0.17 mm(X x Y x Z)の3D幾何学的特徴が、高いパターン品質で正常にパターン化されています。
さらに、このプロトコルと組み合わせて使用できる幾何学的特徴の高さ(Z軸)には限界があることに言及することが重要です。UVフォトパターニングと多くのセルラー読み出しの両方が顕微鏡セットアップに依存しているため、対物レンズの作動距離によってフィーチャの最大高さが決まります。私たちの手の中では、高さ300μmを超える形状は依然としてUVフォトパターン化することができ、40倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して読み出しが行われています。したがって、細胞内から細胞および組織スケールに至るまでのメカノバイオロジカル研究は、記載されたプロトコルを使用して可能である。
考慮する必要がある別の要因は、UV光パターニング49の間または後にサンプルが乾燥するリスクである。これは、凸部が細胞培養材料の外部に露出することが多いため、3D ジオメトリを使用する場合に特に重要です。 図 4 に示すように、これにより、目的のフィーチャの上にタンパク質凝集体が形成される不均一なパターンが生じる可能性があります。タンパク質インキュベーション後および細胞培養中の細胞培養チップの洗浄は、3D形状の適切なコーティングにとって重要です。したがって、細胞培養チップの上には、常に少量の作業溶液(PBS、PLPP、タンパク質溶液、細胞培養培地)を残すことをお勧めします。
これまでのところ、いくつかのタンパク質コーティング(フィブロネクチン、コラーゲンタイプIおよびIV、ゼラチン、FNC)および細胞型(ヒト骨髄間質細胞、ヒト筋線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト角化細胞、および皮膚線維芽細胞)が、構造化細胞培養材料に関する記載されたフォトパターニングアプローチと組み合わせて使用されてきた。以前の研究48で示されているように、タンパク質インキュベーションパラメータの最適化は、新しい細胞型における体系的調査のための鍵である。したがって、新しいタンパク質または細胞で新しい実験を行う前に、さまざまなタンパク質濃度、インキュベーション温度、およびインキュベーション時間を試験することをお勧めします。均質でパターン化された平坦な領域での初期接着後の細胞形態を、「正常な」細胞培養条件下での細胞形態と比較することにより、最適化された実験パラメータのセットを得ることができる。さらに、各細胞型は、特定のマルチキュー環境で認識可能な接着形態を示すために、播種後に異なる時間を必要とする場合があります( 図5参照)。この目的のために、ステップ8.4の洗浄中にパターン化された領域に接触事象を提示するために細胞タイプごとに必要な時間を最適化することが極めて重要である。例えば、ラインパターン上では、ヒト角化細胞は播種後最初の30分以内に細長い形態を示すが、内皮細胞および皮膚線維芽細胞は接着形態の変化を示すまでに数時間かかることが観察された。したがって、タンパク質インキュベーション(ステップ7)および細胞播種(ステップ8)に必要な実験パラメータは、選択するタンパク質および細胞タイプに依存する可能性がある。
3Dジオメトリに接触ガイダンスの手がかりを適用するための提示されたアプローチは、複雑なマルチキュー環境での細胞の動作をより深く理解するのに役立ちます。これには、焦点接着や核などの細胞内成分の調査が含まれ、提案された方法を使用して、より大きな、細胞、または組織スケールで実施される実験も含まれ得る。最終的に、得られた知識は、複雑な細胞環境が所望の結果に向かって細胞挙動を導くように設計されている組織工学アプリケーションの設計に使用することができることが期待される。
The authors have nothing to disclose.
我々は、ヒト初代角化細胞を提供してくれたネロ・フォルミサーノ博士(MERLN技術に触発された再生医療研究所)に感謝する。この研究は、Chemelot InSciTe(プロジェクトBM3.02)によってサポートされています。欧州研究評議会(助成金851960);重力プログラムのための文部科学省024.003.013「材料駆動再生」。著者は、Alvéoleの対応、ヘルプ、トラブルシューティングに感謝します。
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |