Traditionellt utförs cellodling på plana substrat som dåligt efterliknar cellernas naturliga miljö in vivo. Här beskriver vi en metod för att producera cellodlingssubstrat med fysiologiskt relevanta krökta geometrier och mikromönsterade extracellulära proteiner, vilket möjliggör systematiska undersökningar av cellulär avkänning av dessa extracellulära signaler.
Den extracellulära matrisen är en viktig regulator för cellfunktionen. Miljösignaler som finns i den cellulära mikromiljön, såsom ligandfördelning och vävnadsgeometri, har alltmer visat sig spela kritiska roller för att styra cellfenotyp och beteende. Dessa miljösignaler och deras effekter på celler studeras dock ofta separat med hjälp av in vitro-plattformar som isolerar enskilda ledtrådar, en strategi som kraftigt förenklar den komplexa in vivo-situationen för flera ledtrådar. Tekniska tillvägagångssätt kan vara särskilt användbara för att överbrygga detta gap genom att utveckla experimentella inställningar som fångar komplexiteten hos in vivo-mikromiljön , men ändå behåller graden av precision och manipulerbarhet hos in vitro-system .
Denna studie belyser ett tillvägagångssätt som kombinerar ultraviolett (UV) -baserad proteinmönster och litografibaserad substratmikrofabrikation, som tillsammans möjliggör undersökning med hög genomströmning av cellbeteenden i multicue-miljöer. Med hjälp av masklös UV-fotomålning är det möjligt att skapa komplexa, självhäftande proteinfördelningar på tredimensionella (3D) cellodlingssubstrat på chips som innehåller en mängd väldefinierade geometriska ledtrådar. Den föreslagna tekniken kan användas för odlingssubstrat tillverkade av olika polymera material och kombineras med adhesiva mönstrade områden av ett brett spektrum av proteiner. Med detta tillvägagångssätt kan enskilda celler, såväl som monolager, utsättas för kombinationer av geometriska ledtrådar och kontaktvägledningssignaler som presenteras av de mönstrade substraten. Systematisk forskning med kombinationer av chipmaterial, proteinmönster och celltyper kan därmed ge grundläggande insikter i cellulära svar på multikuemiljöer.
In vivo utsätts celler för en mängd olika miljösignaler som kan vara av mekanisk, fysisk och biokemisk natur som härrör från den extracellulära matrisen (ECM). Många miljösignaler har identifierats för att spela viktiga roller i regleringen av cellbeteende, såsom spridning, differentiering och migration 1,2,3,4,5. Ett av de mest undersökta fenomenen är kontaktvägledning, som beskriver vidhäftningsmedierad cellinriktning längs anisotropa biokemiska eller topografiska mönster som finns på det extracellulära substratet 6,7,8,9,10,11. Utöver att styra inriktningen av celler har kontaktvägledningssignaler också visat sig påverka andra cellegenskaper såsom cellmigration, organisering av intracellulära proteiner, cellform och cellöde 12,13,14,15. Dessutom har den geometriska arkitekturen i 3D-cellmiljön också erkänts för dess reglerande inflytande på cellbeteende16,17. I människokroppen utsätts celler för en rad krökta geometrier, allt från kollagenfibrer i mikroskala, kapillärer och glomeruli, upp till mesoskala alveoler och artärer18,19. Intressant nog har nyligen genomförda in vitro-studier visat att celler kan känna av och reagera på sådana fysiska signaler, från nano- tillmesoskalan 20,21,22,23.
Hittills har de flesta studier som undersöker cellsvar på miljösignaler till stor del utförts med hjälp av experimentella inställningar som isolerar enstaka ledtrådar. Även om detta tillvägagångssätt har möjliggjort enorma framsteg när det gäller att förstå de grundläggande mekanismerna bakom cellulär avkänning av miljösignaler, rekapitulerar det dåligt in vivo-miljön som samtidigt presenterar flera ledtrådar. För att överbrygga denna klyfta är det användbart att utveckla kulturplattformar där flera miljösignaler kan kontrolleras oberoende och samtidigt. Detta koncept har fått ökande dragkraft på senare tid24,25, med studier som kombinerar matrisstyvhet och liganddensitet 26,27,28,29, substratstyvhet och porositet30, substratstyvhet och 3D-mikronichevolym31, yttopografi och kontaktvägledningssignaler 32,33,34 och kontaktvägledningssignaler i nanoskala med vägledningssignaler för krökning i mesoskala23. Det är dock fortfarande utmanande att kombinera kontaktvägledningssignaler med en mängd olika 3D-geometrier på ett kontrollerat sätt med hög genomströmning.
Detta forskningsprotokoll behandlar denna utmaning och introducerar en metod för att skapa cellodlingssubstrat med en kontrollerad kombination av mönstrade limområden av ECM-proteiner (kontaktvägledningssignaler) och substratkrökning (geometriska ledtrådar). Detta tillvägagångssätt möjliggör dissektion av cellsvar i en biomimetisk multikumiljö på ett systematiskt och höggenomsläppt sätt. Den förvärvade kunskapen kan hjälpa till att ytterligare förstå cellbeteende i komplexa miljöer och kan användas för att designa lärorika material med egenskaper som styr cellsvar till ett önskat resultat.
3D-protein fotopatterning
Skapande av limområden av ECM-proteiner (kontaktvägledningssignaler) på cellodlingsmaterial kan åstadkommas med hjälp av en mängd olika tekniker, till exempel genom djup-ultraviolett (djup-UV) mönstring eller mikrokontaktutskrift35,36. Djup-UV-mönstring använder UV-ljus som projiceras genom en mask på ett polymert material för att bryta ner passiveringspolymerer på specifika platser på cellodlingssubstratet. Det mönstrade substratet inkuberas sedan med en ligand av intresse, vilket resulterar i limområden som stöder cellfästning och odling på fördefinierade platser 12,37,38. Ett alternativt sätt att införa proteinmönster är genom mikrokontakttryck, där elastomera frimärken som innehåller en önskad form beläggs med ett valfritt protein och pressas på ett cellodlingssubstrat och därigenom överför proteinbeläggningen till vilken celler kan fästa 35,37,39,40 . Tyvärr, eftersom båda teknikerna förlitar sig på maskberedning och mjuka litografimetoder, är experimenten tidskrävande och arbetsintensiva, samt begränsade när det gäller mönsterflexibilitet. Dessutom är både djup-UV-mönstring och mikrokontaktutskrift mest lämpade för plana material och är tekniskt svåra, om inte omöjliga, för mönstring av ligander i en 3D-miljö.
Kombinerade masklös litografi, kemisk ångavsättning och termoformning för att generera mikromönsterade 3D-polymera substrat41. Denna teknik bygger dock på användningen av termoformbara polymerfilmer och erbjuder låg proteinmönsterupplösning (7,5 μm), medan celler har rapporterats svara på geometriska proteinmönster så små som 0,1 μm 2,42. beskrev en annan lovande metod för nanomönster ECM-ligander på substrat som innehåller nano- och mikrometertopografier43. Med hjälp av mikrokontakttryck överfördes ECM-proteiner från polydimetylsiloxan (PDMS) -stämplar till ett termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Därefter tillät den termoresponsiva egenskapen hos pNIPAM-nätverket dem att överföra det tvådimensionella (2D) proteinmönstret till ett topografiskt PDMS-substrat (10-100 μm djupa spår) och därigenom kontrollera lokaliseringen av vidhäftningsställen på topografiska egenskaper. Alla möjliga mikrotopografier kan dock inte mönstras eftersom minskade vätbarhetsproblem gör det svårare att mönstra djupare topografiska substrat. Diken med ett bildförhållande mellan djup och bredd på 2,4 har rapporterats vara den ultimata gränsen för att framgångsrikt överföra mönstret till det topografiska substratet43. Dessutom är flexibiliteten hos olika mönster och upplösningen av de genererade mönstren dålig på grund av kravet på mikrokontaktutskrift.
Detta dokument beskriver en metod som övervinner de ovannämnda flaskhalsarna och erbjuder en flexibel metod med hög genomströmning för att skapa multicue-substrat som kan användas för cellodling (se figur 1). Fysiologiskt relevanta geometrier (cylindrar, kupoler, ellipser och sadelytor) med krökningar från ĸ = 1/2500 till ĸ = 1/125 μm-1 är fördesignade och mikrofabricerade i PDMS-chips . Därefter skapas kontaktvägledningssignaler ovanpå 3D-geometrierna med hjälp av en mängd olika digitala mönsterdesigner genom att använda en fotomålningsteknik med en upplösning så liten som 1,5 μm44. För detta ändamål passiveras PDMS-chipsen initialt för att förhindra att celler och proteiner fäster; detta passiveringsskikt kan sedan avlägsnas genom en kombination av fotoinitiatorn 4-bensoylbenszyl-trimetylammoniumklorid (PLPP) och UV-ljusexponering45. En digital mask är utformad för att specificera platserna för UV-exponering och därmed det område där passiveringsskiktet avlägsnas. Proteiner kan därefter fästa vid dessa områden, vilket möjliggör cellfästning. Eftersom mönstringen utförs med en digital (snarare än en fysisk) mask kan en mängd olika mönster skapas snabbt utan krångel och kostnad som är förknippade med att designa och tillverka ytterligare fotomasker. Dessutom kan ett varierat utbud av ECM-proteiner (t.ex. kollagen typ I, gelatin och fibronektin) mönstras på substratet. Även om detta protokoll utförs med användning av cellodlingschips gjorda av PDMS, kan principen tillämpas på något annat material av intresse46.
Numera studeras cellbeteende ofta på platta odlingssubstrat som saknar komplexiteten hos den inhemska cellmikromiljön. 3D-miljöer som byggnadsställningar och hydrogeler används som ett alternativ. Även om dessa cellodlingsmiljöer förbättrar in vivo-relevansen, är både systematiska studier av cellbeteende och genomförbarheten av avläsningsmetoder fortfarande utmanande. För att systematiskt undersöka cellbeteende på representativa odlingssubstrat behövs konsekventa multikue-substrat som möjliggör mikroskopisk avläsning. Därför beskriver vi i detta protokoll en metod för att skapa multikue cellodlingssubstrat med fysiologiskt relevanta geometrier och mönstrade ECM-proteiner. Den största utmaningen med att kombinera miljösignaler som vävnadsgeometri och kontaktvägledningssignaler på in vitro-plattformar är till stor del av teknisk natur. Konventionella metoder för att tillämpa kontaktvägledningssignaler (t.ex. mjuk litografi, djup-UV-mönstring och mikrokontaktutskrift35,36) på cellodlingsmaterial har optimerats för plana substrat. Behovet av 3D-cellodlingsmaterial i kombination med kontaktvägledningssignaler belyste flera tekniska utmaningar, såsom dålig mönsterjustering, upplösning och flexibilitet. För att övervinna dessa utmaningar kan en masklös, ljusbaserad mönstringsmetod med hög genomströmning användas45,49. Här möjliggör ett optiskt mikroskop exakt mönsterjustering och en upplösning i storleksordningen mikrometer (se figur 6). Vidare gör användningen av en digital mask det möjligt för forskare att studera cellbeteende på ett brett spektrum av mönster utan att behöva tillverka arbetsintensiva fysiska masker.
UV-fotomålningsmetoden kan användas i kombination med en mängd olika 3D-geometrier (t.ex. cylindrar, sadlar, kupoler, gropar) tillverkade av en rad olika material48. 3D-cellodlingssubstraten som används i denna studie är gjorda av PDMS; andra material kan dock också användas. Detta kan kräva olika steg för att producera det slutliga cellodlingssubstratet som innehåller de egenskaper som är av intresse. Eftersom celler har visat sig vara känsliga för ytjämnhet hos cellodlingsmaterial är det viktigt att skapa cellodlingschipsen med en slät yta så att de observerade cellernas svar helt kan hänföras till 3D-geometrin och kontaktvägledningssignalerna50,51. Mätmetoder som optisk profilometri, svepelektronmikroskopi eller atomkraftsmikroskopi kan användas för att mäta ytjämnhet. Efter tillverkning av cellodlingsmaterialet kan man välja en mönstringsmetod baserad på ett eller flera fokalplan beroende på de specifika dimensionerna för funktionen av intresse (se figur 3). Vanligtvis används ett enda fokalplan för att mönstra ett område inom ett Z-intervall på cirka 50 μm. Mönsterupplösningen visade sig vara konsekvent med hjälp av denna tumregel (se figur 6). En nackdel med denna metod är dock den ökade mönstringstiden med införandet av flera fokala plan och mönster. I vår hand, med hjälp av flera fokalplan, har 3D-geometriska funktioner upp till 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) framgångsrikt mönstrats med hög mönsterkvalitet.
Dessutom är det viktigt att nämna att höjden (Z-axeln) på geometriska egenskaper som kan användas i kombination med detta protokoll är begränsad. Eftersom både UV-fotofärgningen och många cellulära avläsningar är beroende av en mikroskopiinställning, bestämmer målens arbetsavstånd den maximala höjden för en funktion. I vår hand kan geometrier som överstiger en höjd av 300 μm fortfarande UV-fotomönster, och avläsningar har utförts med hjälp av ett konfokalmikroskop med 40x mål. Således är mekanobiologisk forskning som sträcker sig från intracellulära till cellulära och vävnadsskalor möjlig med hjälp av det beskrivna protokollet.
En annan faktor som måste beaktas är risken för att prover torkar ut under eller efter UV-fotofärgningen49. Detta är särskilt relevant vid användning av 3D-geometrier, eftersom konvexiteter ofta exponeras utanför cellodlingsmaterial. Som visas i figur 4 kan detta resultera i ojämna mönster med proteinaggregat som bildas ovanpå funktionen av intresse. Tvättningen av cellodlingschipsen efter proteininkubation och under cellodling är avgörande för korrekt beläggning av 3D-geometrier. Därför rekommenderas det att alltid lämna små volymer av en arbetslösning (PBS, PLPP, proteinlösning, cellodlingsmedium) ovanpå cellodlingschipet.
Hittills har flera proteinbeläggningar (fibronektin, kollagen typ I och IV, gelatin, FNC) och celltyper (humana benmärgsstromaceller, humana myofibroblaster, humana endotelceller, humana keratocyter och dermala fibroblaster) använts i kombination med den beskrivna fotopatterningsmetoden på strukturerade cellodlingsmaterial. Som visats i en tidigare studie48 är optimeringen av proteininkubationsparametrar nyckeln till systematisk undersökning i nya celltyper. Innan du utför ett nytt experiment med nya proteiner eller celler rekommenderas det därför att testa en rad proteinkoncentrationer, inkubationstemperaturer och inkubationstider. Genom att jämföra cellmorfologi efter initial vidhäftning på homogena, mönstrade plana ytor med cellmorfologi under “normala” cellodlingsförhållanden kan en optimerad uppsättning experimentella parametrar erhållas. Dessutom kan varje celltyp kräva olika lång tid efter sådd för att visa en igenkännbar vidhäftningsmorfologi i en specifik multikuemiljö (se figur 5). För detta ändamål är det viktigt att optimera den tid som krävs per celltyp för att presentera kontakthändelser på det mönstrade området under tvätten i steg 8.4. Till exempel observerade vi att humana keratocyter på nätet visar långsträckta morfologier inom de första 30 minuterna efter sådd, medan endotelceller och dermala fibroblaster kräver flera timmar innan de visar en förändring i vidhäftningsmorfologi. De experimentella parametrar som krävs för proteininkubation (steg 7) och cellsådd (steg 8) kan således vara beroende av vilket protein och vilken celltyp som väljs.
Den presenterade metoden för att tillämpa kontaktvägledningssignaler på 3D-geometrier kan hjälpa till att skapa en djupare förståelse för cellbeteende i komplexa multicue-miljöer. Detta kan inkludera undersökningar av intracellulära komponenter, såsom fokala vidhäftningar och kärnor, och kan också involvera experiment utförda på en större cell- eller vävnadsskala med den föreslagna metoden. Så småningom förväntas den kunskap som erhållits kunna användas i utformningen av vävnadstekniska applikationer, där komplexa cellulära miljöer är utformade för att styra cellbeteende mot ett önskat resultat.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) för att ha tillhandahållit humana primära keratocyter. Detta arbete har fått stöd av Chemelot InSciTe (projekt BM3.02); Europeiska forskningsrådet (anslag 851960). och ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap för gravitationsprogrammet 024.003.013 “Materialdriven regenerering”. Författarna vill tacka Alvéole för deras korrespondens, hjälp och felsökning.
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |