प्लाज्मा और ठोस ऊतकों से पता लगाने योग्य और कार्यात्मक बाह्य पुटिकाओं का अलगाव और विश्लेषण

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल सतह एंटीजन और प्रोटीन कार्गो की बाद की रूपरेखा के साथ परिधीय रक्त और ठोस ऊतकों से बाह्य पुटिकाओं को निकालने की एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

परिसंचारी और ऊतक-निवासी बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (ईवी) उपन्यास थेरानोस्टिक बायोमार्कर के रूप में आशाजनक लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं, और वे जीव होमियोस्टैसिस के रखरखाव और रोगों के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम की प्रगति में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में उभरते हैं। जबकि वर्तमान शोध एंडोसोमल मूल के साथ अंतर्जात एक्सोसोम के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है, प्लाज्मा झिल्ली से माइक्रोवेसिकल्स ब्लीबिंग ने स्वास्थ्य और बीमारी में बढ़ते ध्यान आकर्षित किया है, जो मूल कोशिकाओं के झिल्ली हस्ताक्षर को पुन: उत्पन्न करने वाले सतह अणुओं की बहुतायत द्वारा चित्रित हैं। यहां, प्लाज्मा और ठोस ऊतकों, जैसे हड्डी से ईवी निकालने और चिह्नित करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के आधार पर एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया प्रस्तुत की जाती है। प्रोटोकॉल में आगे ईवी के सतह एंटीजन और प्रोटीन कार्गो की बाद की प्रोफाइलिंग का वर्णन किया गया है, जो इस प्रकार उनकी व्युत्पत्ति के लिए पता लगाने योग्य हैं और संभावित कार्य से संबंधित घटकों के साथ पहचाने जाते हैं। यह विधि जैविक, शारीरिक और पैथोलॉजिकल अध्ययनों में ईवी के सहसंबंधी, कार्यात्मक और यंत्रवत विश्लेषण के लिए उपयोगी होगी।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) को सेल-रिलीज़ लिपिड बाइलेयर-संलग्न बाह्य संरचनाओं^को परिभाषित करने के लिए प्रस्तावित किया गया है1, जो विभिन्न शारीरिक और रोग^{संबंधी घटनाओं में} महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। स्वस्थ कोशिकाओं द्वारा जारी ईवी को मोटे तौर पर दो मुख्य श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है, अर्थात् एक्सोसोम (या छोटे ईवी) जो इंट्रासेल्युलर एंडोसाइटिक ट्रैफिकिंग पाथवे³ के माध्यम से बनते हैं और माइक्रोवेसिकल्स (या बड़े ईवी) कोशिका⁴ के प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी नवोदित द्वारा विकसित होते हैं। जबकि कई अध्ययन विट्रो⁵ में सुसंस्कृत कोशिकाओं से एकत्र किए गए ईवी के कार्य पर ध्यान केंद्रित करते हैं, परिसंचरण या ऊतकों से प्राप्त ईवी अधिक जटिल और विषम होते हैं, जिनके पास विवो⁶ में जीव की वास्तविक स्थिति को प्रतिबिंबित करने का लाभ होता है। इसके अलावा, लगभग सभी प्रकार के ऊतक विवो में ईवी का उत्पादन कर सकते हैं, और ये ईवी ऊतक के भीतर संदेशवाहक के रूप में कार्य कर सकते हैं या^{प्रणालीगत संचार की} सुविधा के लिए शरीर के विभिन्न तरल पदार्थ, विशेष रूप से परिधीय रक्त द्वारा स्थानांतरित किए जा सकते हैं। परिसंचरण और ऊतकों में ईवी रोग निदान^{और उपचार के} लिए भी लक्ष्य हैं।

जबकि एक्सोसोम का हाल के वर्षों में गहन अध्ययन किया गया है, माइक्रोवेसिकल्स में महत्वपूर्ण जैविक कार्य भी हैं, जिन्हें अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बिना आसानी से निकाला जा सकता है, इस प्रकार बुनियादी और^{नैदानिक अनुसंधान को} बढ़ावा दिया जा सकता है। विशेष रूप से, परिसंचरण और ऊतकों से अलग ईवी के बारे में एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि वे विभिन्न सेल प्रकारों^से प्राप्त होते हैं। चूंकि माइक्रोवेसिकल्स प्लाज्मा झिल्ली से धब्बेदार होते हैं और सेल^{सतह अणुओं की} बहुतायत द्वारा चित्रित होते हैं, इसलिए इन ईवी की सेलुलर उत्पत्ति की पहचान करने के लिए मूल कोशिका झिल्ली मार्करों का उपयोग करना संभव है। विशेष रूप से, फ्लो साइटोमेट्री (एफसी) तकनीक को झिल्ली मार्करों का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, शोधकर्ता ईवी को अलग कर सकते हैं और कार्यात्मक कार्गो के आधार पर आगे का विश्लेषण कर सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल विवो नमूनों में से ईवी निकालने और चिह्नित करने के लिए एक संपूर्ण प्रक्रिया प्रदान करता है। ईवी को अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से अलग किया जाता है, और ईवी के लक्षण वर्णन में नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के माध्यम से रूपात्मक पहचान, एफसी के माध्यम से उत्पत्ति विश्लेषण और पश्चिमी धब्बा के माध्यम से प्रोटीन कार्गो विश्लेषण शामिल है। चूहों के रक्त प्लाज्मा और मैक्सिलरी हड्डी का उपयोग प्रतिनिधियों के रूप में किया जाता है। शोधकर्ता अन्य स्रोतों से ईवी के लिए इस प्रोटोकॉल का उल्लेख कर सकते हैं और संबंधित संशोधन कर सकते हैं।

Protocol

पशु प्रयोग ों को चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों और आगमन दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए, 8 सप्ताह के C57Bl/6 चूहों (महि?…

Representative Results

प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो के अनुसार, ईवी को परिधीय रक्त और ठोस ऊतकों से निकाला जा सकता है (चित्रा 1)। 8 सप्ताह की आयु के माउस की मैक्सिलरी हड्डी लगभग 0.1 ± 0.05 ग्राम है, और माउस से लगभग 300 μL प्लाज्मा एकत्र…

Discussion

ईवी की विशेषताओं, भाग्य और कार्य का अध्ययन करते समय, उच्च उपज और कम संदूषण वाले ईवी को अलग करना महत्वपूर्ण है। ईवी निकालने के लिए विभिन्न तरीके मौजूद हैं, जैसे घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी), आकार-बह?…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot