O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.
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Artigo de método
Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As vesículas extracelulares (EVs) circulantes e residentes nos tecidos representam alvos promissores como novos biomarcadores teranósticos, e emergem como importantes atores na manutenção da homeostase do organismo e na progressão de um amplo espectro de doenças. Enquanto a pesquisa atual se concentra na caracterização de exossomos endógenos com origem endossomal, microvesículas que sopram da membrana plasmática têm ganhado atenção crescente na saúde e na doença, que são caracterizadas por uma abundância de moléculas de superfície recapitulando a assinatura da membrana das células parentais. Aqui, um procedimento reprodutível é apresentado baseado na centrifugação diferencial para extrair e caracterizar EVs do plasma e tecidos sólidos, como o osso. O protocolo descreve ainda o perfil subsequente de antígenos de superfície e cargas proteicas de EVs, que são rastreáveis por suas derivações e identificados com componentes relacionados à função potencial. Este método será útil para análise correlacional, funcional e mecanística de EVs em estudos biológicos, fisiológicos e patológicos.
Introdução
Vesículas extracelulares (EVs) têm sido propostas para definir estruturas extracelulares liberadas de lipídios e fechadas por bicamadas1, que desempenham papéis importantes em vários eventos fisiológicos e patológicos2. Os EVs liberados por células saudáveis podem ser amplamente divididos em duas categorias principais, a saber, exossomos (ou pequenos EVs) formados através de uma via de tráfego endocítico intracelular3 e microvesículas (ou grandes EVs) desenvolvidas pelo brotamento externo da membrana plasmática da célula4. Enquanto muitos estudos enfocam a função dos EVs co....
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Protocolo
Os experimentos com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Quarta Universidade Médica Militar e as diretrizes do ARRIVE. Para o presente estudo, camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade (sem preferência por fêmeas ou machos) foram utilizados. As etapas envolvidas no isolamento dos EVs plasmáticos e teciduais estão ilustradas na Figura 1. O plasma é tomado como um representante para descrever o procedimento de isolamento EV de fluidos corporais. O osso maxilar é tomado como um representante para explicar o procedimento de isolamento EV dos tecidos sólidos.
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Resultados
De acordo com o fluxo de trabalho experimental, os VE podem ser extraídos do sangue periférico e dos tecidos sólidos (Figura 1). O osso maxilar de um camundongo com 8 semanas de idade é de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, e cerca de 300 μL de plasma podem ser coletados do camundongo. Seguindo as etapas do protocolo, 0,3 mg e 3 μg de VE podem ser coletados, respectivamente. Conforme analisado por MET e NTA, as características morfológicas típicas dos EVs são vesículas redondas de membrana em for.......
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Discussão
Ao estudar as características, o destino e a função dos EVs, é crucial isolar EVs com alto rendimento e baixa contaminação. Existem vários métodos para extrair EVs, como centrifugação por gradiente de densidade (DGC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e ensaios de imunocaptura 4,20. Aqui, um dos métodos mais comumente utilizados, a centrifugação diferencial, foi usado; as vantagens disso são que não é demorado, gera um alto rendimento de EVs com fácil is.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81870796, 82170988 e 81930025) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldeído | Microscópio eletrônico de transmissão | 143174 Biosharp | |
| Anticorpo secundário anti-cabra Alexa fluor 488 | Yeason | 34306ES60 | Citometria de fluxo |
| Alexa fluor 488 anticorpo secundário de coelho | Invitrogen | A11008 | Citometria de fluxo |
| Anticorpo anti-CD18 | Abcam | ab131044 | Citometria de fluxo |
| Anticorpo anti-CD81 | Abcam ab109201 | Anticorpo anti-CD9 Western blot | |
| Huabio | ET1601-9 | ||
| Anticorpo anti-mitofilina | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| Kit de ensaio de proteína BCA | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Albumina de soro bovino | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Anticorpo Caveolina-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Coloração laranja da membrana plasmática | Invitrogen | C10045 | Citometria de fluxo |
| Quimioluminescência | Amersham Biosciences | N / A | Western blot |
| Tesoura de operação curva | JZ Instrumento cirúrgico | J21040 | EV isolamento |
| Balança eletrônica | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolamento |
| Epoch espectrofotômetro | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubos | Eppendorf Eppendorf | 3810X | EV isolamento |
| Flotillin-1 anticorpo | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Sistema de imagem em gel | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Grades de Western blot |
| - Formvar/Carbon Coated - Cobre 200 mesh | Polysciences | 24915 | Microscópio eletrônico de transmissão |
| de heparina | Célula-tronco | 7980 | EV isolamento |
| Liberase Grau de pesquisa | Sigma-Aldrich | 5401127001 | isolamento EV |
| Pinça microscópica | JZ Instrumento cirúrgico | JD1020 | EV isolamento |
| NovoCyte citômetro de fluxo | ACEA | N/A | Citometria de fluxo |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Géis Hepes 4~20%, 10 poços | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR( D-19) anticorpo | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Citometria de fluxo |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anestesia |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Ácido fosfotúngstico | RHAWN | 12501-23-4 | Microscópio eletrônico de transmissão |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Sinalização Celular | 4053t | Western blot |
| Filme de polietileno (PE) | Xiang yi | 200150055 | Microscópio eletrônico de transmissão |
| Membranas de fluoreto de polivinilideno | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Inibidores de protease | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Anticorpo anti-PGD recombinante | Abcam | ab129199 | Western blot |
| Tampão de lise RIPA | Beyotime | P0013 | Western blot |
| Tampão de carregamento SDS-PAGE (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Grânulos de | tamanhoInvitrogen | F13839 | Citometria de fluxo |
| Microcentrífugas de mesa de alta velocidade | Hitachi | CT15E | EV isolamento |
| Microscópio eletrônico de transmissão | HITACHI | H-7650 | Microscópio eletrônico de transmissão |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolamento |
| ZetaView BASIC NTA - Microscópio de Vídeo de Rastreamento de Nanopartículas PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Análise de rastreamento de nanopartículas |
| &alfa;-Actinina-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actina | Cwbio | CW0096M | Western blot |
Referências
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C.
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Reimpressões e permissões
