Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Summary

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Abstract

Uma linhagem reversa de transcriptase (Tert) foi desenvolvida para investigar o comportamento e o destino das células-tronco de tecido adulto, cruzando o sistema ‘Tet-On’ oTet-Cre mouse com um novo transactivador de tetraciclina reversa (rtTA) transgene ligado ao promotor tert, que demonstramos uma nova população de células-tronco cerebrais adultas. Aqui, a administração da doxiciclina derivada de tetraciclina para mTert-rtTA::oTet-Cre marcará indelévelmente uma população de células que expressam um fragmento de 4,4 kb da região promotora do gene Tert. Quando combinados o repórter Rosa-mTmG, mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratos expressarão membrana tdTomato (mTomato) até que o tratamento da doxiciclina induz a substituição da expressão mTomato por membrana EGFP (mGFP) em células que também expressam Tert. Portanto, quando esses camundongos de rastreamento de linhagem tripla-transgênica recebem doxiciclina (o período de “pulso” durante o qual as células expressas tert são marcadas), essas células se tornarão indelibavelmente marcadas células mGFP+, que podem ser rastreadas por qualquer quantidade desejável de tempo após a remoção da doxiciclina (o período de “perseguição”), mesmo que a expressão tert seja posteriormente perdida. Os cérebros são então fixos e processados por imunofluorescência e outras aplicações a jusante, a fim de interpretar mudanças na ativação de células-tronco, proliferação, compromisso de linhagem, migração para vários nichos cerebrais e diferenciação para tipos de células maduras. Usando este sistema, qualquer mouse rtTA pode ser acoplado a oTet-Cre e um repórter Rosa para conduzir experimentos de rastreamento de linhagem “pulse-chase” indutíveis de doxiciclina usando marcadores de células-tronco.

Introduction

Valor de uma linhagem de rastreamento de linhagem linha do mouse
A análise das células-tronco in vivo pode ser difícil, já que muitos ensaios que examinam tais células só se concentram em caracterizar essas células no momento da morte do animal, o que representa um instantâneo terminal no tempo. Para entender melhor os processos de proliferação, diferenciação e migração de progenitor, tipos de células intermediárias/transitórias e células maduras ao longo do tempo, é necessária uma abordagem de análise longitudinal. Isso pode ser alcançado com estudos de rastreamento de linhagem pelos quais as células-tronco/progenitoras são marcadas indelévelmente e podem ser seguidas por qualquer período de tempo depois^{de 1}.

No cérebro adulto de mamíferos, o processo de neurogênese pelo qual os neurônios nascidos em adultos são criados a partir de células-tronco e progenitoras foi primeiro analisado através da retenção de rótulos com timmidina-H^{3 2,3,4} ou 5-bromo-2′-deoxyuridina (R$ ^5,6,7,8 . Nesses estudos, as células proliferativas foram marcadas com o analógico timina, que foi incorporado ao DNA das células durante a replicação e divisão/proliferação celular. A célula marcada, bem como sua descendência, continha, portanto, este analógico, que foram então identificados após a morte. No entanto, enquanto a timmidina-H³ e a BrdU permitiram a marcação de células proliferativas e sua descendência em regiões cerebrais onde as células-tronco eram mal compreendidas, esses estudos foram dificultados pelas desvantagens dessas ferramentas. A thymidine-H³ induz a prisão do ciclo celular, apoptose e a inibição da síntese de DNA dependente de dose⁹, enquanto brdU marca células em níveis variados dependendo da rota da administração¹⁰ e é tomada por células durante o reparo ou apoptose, bem como durante a divisão^{celular 11}. Métodos de rotulagem mais eficientes têm sido utilizados recentemente, como rotulagem com 5-ethynyl-2′-deoxyuridina (EdU), mas muitos dos mesmos problemas que brdU ainda permanecem¹². Essas abordagens também são limitantes na medida em que marcam qualquer célula proliferativa, não apenas células-tronco, e, portanto, a interpretação dos resultados pode ser confundida. Na linhagem neurogênica, todas as células-tronco e progenitoras retêm capacidade mitótica, e apenas neurônios terminais/maduros não são proliferativos. Para os astrócitos e microglia, mas não oligodendrocitos, a proliferação é mantida indefinidamente 13,14,15.

Camundongos transgênicos usados para fazer linhagem apenas células que expressam uma proteína de interesse, como uma confirmada para identificar células-tronco adultas como usamos aqui, tornaram-se, portanto, mais comuns ao investigar células-tronco e sua descendência. Embora difícil de gerar através de abordagens transgênicas de camundongos, linhas de mouse de rastreamento de linhagem permitem o rastreamento de células especificamente marcadas no cérebro, e não dependem apenas da proliferação. No sistema de camundongos transgênicos Tet-On, a administração de tetraciclina ou doxiciclina (um derivado de tetraciclina) induz a expressão cre-recombinase em células que foram projetadas com um transactivador de tetraciclina reversa (rtTA), que é transcrito por um promotor de interesse. A recombinação indutível de Cre indutível de Tet ativará então a expressão de uma proteína fluorescente ou luminescente indelével nas células de interesse, dependendo do rato rosa-repórter empregado. Essas células indelibavelmente marcadas continuam a expressar este repórter após divisão, diferenciação ou migração, permitindo o rastreamento dessas células e sua descendência ao longo do tempo ou após diferentes intervenções¹⁶. As vantagens das abordagens transgênicas de rastreamento de linhagem incluem: 1) especificidade do rastreamento a uma determinada linhagem celular ou progenitor/célula-tronco marcada pela tTA, 2) expressão indelével da proteína fluorescente ou luminescente, apesar da rotatividade ou diferenciação celular, 3) baixa toxicidade, 4) ativação condicional durante qualquer ponto do ciclo de vida do animal, e 5) facilidade de uso com ensaios comuns, incluindo imunossaluscência/imunofluorescência¹⁶.

Outros métodos de ferramentas de repórteres temporalmente indutíveis em camundongos incluem o uso de ratos Cre-ERT2, que podem ser emparelhados com ROSA-GFP, ROSA-mTmG ou outros transgenes fluorescentes. Nesses animais, um elemento regulatório específico para células, como um promotor ou região de interesse melhorador, impulsiona a produção de Cre recombinase, que só pode ser ativada através da administração de tamoxifen. Enquanto as linhas de camundongos Cre-ERT2 permitem a indução de Cre em linhas celulares específicas, há uma riqueza de conhecimento detalhando os efeitos do tamoxifen na neurogênese adulta^17,18. Além disso, existem muitos genes de repórteres fluorescentes orientados por ROSA que podem ser utilizados em vez de GFP ou mTmG, incluindo YFP ou CFP, o que permitiria rotulagem fluorescente alternativa em outros comprimentos de onda fluorescentes. Estes genes fluorescentes de repórteres podem ser usados com sistemas Tet-On ou Cre-ERT2.

Telomerase reverse transcriptase (TERT) é o componente limitante de taxa da holoenzima telomerase, que trabalha para estender telômeros depois de encurtados durante a divisão^{celular 19,20}. TERT foi identificado como um marcador de células-tronco de tecido adulto no intestino^21,22, medula óssea²¹, fígado²³, adiposo²⁴, endométrio^25,26 e osso¹. Ainda não se sabe se a expressão TERT nessas células-tronco adultas é unicamente para atividade de extensão de telomerase ou para desempenhar papéis tert não^{canônicos 27}. Células-tronco adultas quiescentes (qASCs) que expressam TERT foram identificadas e traçadas em todo o corpo com camundongos de linhagem transgênica para estudar a capacidade de multipotência e autoconexação dessas células-tronco, bem como seu potencial de ativar, proliferar, diferenciar e migrar 1,22,23,28. A criação do transgene Tert-rtTA foi realizada anteriormente¹. Neste artigo, descreveremos o uso de uma linhagem traçando linhagem da linhagem tert linha de mouse para estudar TERT + qASCs que identificamos como uma nova população ASC no cérebro de camundongo adulto.

Geração de linhagem transgênica traçando linha do mouse
Para gerar uma linhagem de mouses com rastreamento de linhagem usando o sistema Tet-On, três transgenes devem ser combinados dentro de um único animal através do acasalamento do rato. A primeira é uma rtTA, expressa sob o controle do promotor do gene de interesse (o nosso é TERT-rtTA). Em uma célula que expressa esse gene de interesse, o rtTA será, portanto, expresso. O segundo é um gene oTet-Cre, que contém um elemento de resposta tetraciclina (TRE) que permitirá a transcrição de Cre recombinase na presença de uma transcrição de fusão rtTA e tetraciclina ou doxiciclina. Tetraciclina ou doxiciclina podem ser administradas a um animal através de água potável ou chow²⁹. Finalmente, deve haver um gene que será ativado por Cre recombinase decote. Neste manuscrito, o gene de rotulagem que descreveremos é o gene Rosa26-mTmG, que até a recombinação de Cre transcreverá onipresentemente mTomato (fluorescência vermelha de membrana em todas as células). No entanto, se uma célula expressa a transcrição rtTA e contém tetraciclina ou doxiciclina, a recombinação de cre de um conjunto de locais lox P entre os locais mTomato e mGFP mudará o local R26 e fará com que a célula produza membrana EGFP (mGFP, ou fluorescência verde de membrana) em vez de tomate de membrana. A natureza indelével deste sinal mGFP permitirá a rotulagem in vivo e o rastreamento das células à medida que proliferam, migram e diferenciam. Seguindo o rastreamento, as células podem ser analisadas para expressão de GFP via imunofluorescência em crioseções padrão ou cérebros mais espessos odocendo opticamente.

Neste artigo, descreveremos o uso da linha específica do mouse, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Para criar esta linha de camundongos transgênicos triplos, primeiro acasalamos animais oTet-Cre (The Jackson Lab strain #006234) para animais Rosa-mTmG (The Jackson Lab strain #007676) para criar oTet-Cre::Rosa-mTmG camundongos transgênicos duplos. Estes animais foram genótipados com primers e modelos PCR indicados nas Tabelas Suplementares 1 e 2. os camundongos mTert-rtTA (criados por David Breault¹) foram acasalados para animais oTet-Cre::Rosa-mTmG para criar mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG ratos (Figura 1A)^1,30. O mecanismo de ação da linha de mouse mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mouse line é ilustrado na Figura 1B.

Indução de doxiciclina e design de perseguição de pulso
Ao planejar experimentos, é importante considerar vários fatores que afetarão o resultado de experimentos de rastreamento de linhagem, incluindo a idade do animal na indução de doxiciclina, o tempo de administração da doxiciclina (o período de “pulso”), o tempo após a remoção da doxiciclina antes da coleta de tecidos (o período de “perseguição”), e o tempo de qualquer intervenção durante esses processos. Essas considerações de design do estudo são essenciais para a compreensão das células rotuladas e de sua descendência na conclusão do experimento. O primeiro passo do processo é identificar a idade de interesse do animal e a duração da administração doxiciclina. Períodos de pulso mais longos permitirão que o potencial de mais células expressem que o promotor vinculado ao RTTA seja expresso e mais células de interesse sejam marcadas indelibavelmente. Um tipo de célula que exibe expressão transitória do gene de interesse pode exigir um período de pulso mais longo do que células que expressam continuamente o gene de interesse. No entanto, se o objetivo do estudo é entender os efeitos de curto prazo da célula de interesse ou uma intervenção aguda, o período de pulso não pode ser muito longo, pois uma vez que uma célula é marcada, ela será rastreada através de qualquer número de alterações durante o restante do período de pulso. Em alguns de nossos estudos, um pulso de 2 dias sem período de perseguição foi usado para imitar mais de perto um repórter direto para tert. Isso porque o tempo mínimo de recombinação do gene Rosa-mTmG é de 2 dias³¹.

O próximo período essencial em um experimento de perseguição de pulso é o comprimento entre a remoção da doxiciclina e a perfusão do animal, também conhecido como a “perseguição”. A meia-vida da doxiciclina em camundongos é de aproximadamente 170 minutos, independentemente da rota de administração, permitindo a conclusão de que a indução de doxiciclina provavelmente não ocorre mais várias horas após a remoção³². No entanto, é importante notar que o metabolismo da doxiciclina é mais lento em camundongos idosos, o que pode levar a períodos de “pulso” mais eficazes do que animais jovens³³.

Durante o período de perseguição, as células rotuladas continuarão a ser rotuladas, mesmo após a proliferação, diferenciação ou migração. A prole dessas células também será rotulada. O objetivo do estudo moldará o comprimento do paradigma de perseguição de pulso. Se o objetivo do estudo é entender a regeneração de um tecido durante um longo período de tempo com as células de interesse, um longo período de perseguição pode ser necessário. Por fim, deve-se decidir o tempo de quaisquer intervenções ou tratamentos. A administração durante o período de pulso afetará as células que expressam o gene de interesse, bem como qualquer prole criada durante este tempo, enquanto a administração durante o período de perseguição pode afetar principalmente a prole das células de interesse, embora isso dependa da rapidez com que as células rotuladas se dividem ou se diferenciam. Exemplos de projetos experimentais de perseguição de pulso que utilizamos estão descritos na Figura 2A.

Também é importante estar ciente da possibilidade de sinal GFP de fundo devido à expressão vazada. A expressão de vazamento ocorre como resultado do potencial de ligação inerente entre as sequências de TR ET na ausência de doxiciclina e atividade residual do transgene Otet na ausência de tTA (revisado em³⁴). A expressão de vazamento representa uma fraqueza dos sistemas Tet, e embora o vazamento seja muitas vezes uma desvantagem aceitável para o sistema, situações em que a expressão vazada pode levar à toxicidade e mortalidade, como com a toxina de difteria (DTA) em animais Otet-DTA pode limitar o uso desses sistemas³⁵.

Processamento cerebral, secção e imunofluorescência de seções finas para microscopia
Para analisar os cérebros de camundongos após um experimento de rastreamento de linhagem, os camundongos devem primeiro ser perfusados via perfusão transcárrica para remover sangue e CSF que podem levar a alta autofluorescência no cérebro. Existem dois fixativos comumente usados com os seguintes fixadores: Tecido Histochoice Fixativo, fixador glixal (GF), ou 4% paraformaldeído (PFA). Fixações glicoxais permitem um processo de fixação relativamente suave com menos ligação cruzada do que o PFA. Isso reduz a rigidez tecidual, reduz a necessidade de recuperação de antígenos e permite soluções de anticorpos menos concentradas durante a imunossuagem. No entanto, se eles contêm metanol, isso pode servir para aumentar a autofluorescência³⁶. Por outro lado, a PFA muitas vezes permitirá uma fixação mais robusta, e enquanto a recuperação de antígenos será necessária durante a imunostaining, existem anticorpos que só funcionarão com tecidos fixos pfa, e a perfusão com 4% de PFA é necessária para a técnica de compensação óptica descrita posteriormente.

Seguir a perfusão é uma etapa pós-fixação, na qual os cérebros são imersos no mesmo tipo de fixação utilizado durante a perfusão durante a noite. Isso permite que quaisquer regiões cerebrais que possam não ter sido totalmente fixas durante a perfusão continuem a ser consertadas. Em seguida, os cérebros serão incubados em sacarose em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover o máximo de água possível antes da etapa de congelamento para evitar a formação de gelo dentro do tecido (“criopreservação”). Os cérebros podem então ser cortados em qualquer número de seções de tecido sagital, coronal ou transversal para processamento. Tanto para precisão quanto para a reprodutibilidade, os blocos cerebrais calibrados precisam ser usados de forma a garantir cortes consistentes de bregma entre os animais. O fator mais importante que pode afetar a forma como os cérebros são seccionados é a região cerebral de interesse. Por exemplo, enquanto um corte sagital pode permitir que mais regiões cerebrais sejam analisadas em uma seção de tecido, este corte não permitirá a análise de regiões neuro/gliogênicas da zona ventricular-subventricular (V-SVZ) como os lados lateral e medial do ventrículo lateral serão impossíveis de discernir nessa dimensão e são melhor observados no plano coronal. Esta pode ser uma distinção importante a ser vista em estudos de neurogênese adulta, já que o lado lateral do ventrículo lateral contém o V-SVZ neurogênico, enquanto a parede medial do ventrículo lateral é um nicho mais gliogênico³⁷.

Depois que os tecidos forem divididos em seções coronais, sagiais ou transversais, eles serão congelados em blocos usando a solução de incorporação da Temperatura de Resfriamento Ideal (OCT). Aqui, os cérebros são congelados dentro deste material de incorporação, com o uso de uma mistura de gelo seco e etanol. Se for necessária uma análise fina da seção, os blocos serão cortados em um criostat e, dependendo da análise a jusante necessária, podem ser aderidos a lâminas de vidro carregadas positivamente como seções finas (<20 μm). Slides de vidro que não são carregados também podem ser usados, mas o uso de lâminas não carregadas pode resultar em tecidos se desprenderem dos slides³⁸. Se forem necessárias seções de tecido flutuante de média espessura (>20 μm), os tecidos serão coletados como seções flutuantes livres. Se forem necessárias seções grossas (0,5-4 mm), é necessário cortar seções cerebrais não congeladas com vibratome. É importante observar as diferenças de armazenamento entre as seções em slides, que requerem congelamento de -20 a -80 °C e seções flutuantes livres, que serão armazenadas a 4 °C.

Limpeza cerebral e microscopia confocal de montagem completa
Se uma análise mais ampla, mas menos detalhada das células traçadas de linhagem no cérebro do camundongo for desejada, uma análise abrangente de segmentos mais espessos do tecido cerebral é possível com o esclarecimento cerebral iDISCO³⁹ seguido de microscopia confocal de imunostaining e tiled z-stack ou microscopia de folha de luz. Aqui, grandes seções do cérebro do rato serão apagadas opticamente (um processo de delipidação³⁹), o que permite melhor a imagem de sinal fluorescente em uma seção de tecido de 1 mm. As desvantagens desse processo são a alta autofluorescência e a diminuição da capacidade de obter imagens de alta resolução da morfologia celular e análise detalhada de co-coloração devido ao aumento das distâncias de trabalho necessárias quando comparadas aos métodos mais tradicionais (crioseções finas ou seções flutuantes livres). Por essa razão, recomendamos a limpeza cerebral para analisar os resultados de rastreamento de linhagem em larga escala em várias áreas cerebrais, em vez de tentar caracterizar ou analisar células individuais.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Estadual de Ohio. 1. Criação de uma linhagem traçando linhagem Tet-On linha de camundongos, estratégias de reprodução e genotipagem para camundongos de coorte experimental NOTA: Aqui, descrevemos a criação de um sistema de mouse Tet-On com Rosa-mTmG como o gene repórter fluorescente que sofre recombinação da Cre, …

Representative Results

Embora o sinal fluorescente resultante de um sistema Tet-On com um repórter fluorescente varie dependendo do promotor de interesse e fluoróforo(s) usado, descreveremos como os achados foram analisados com animais mTert-rtTA:::oTet-Cre::Rosa-mTmG animais. A análise dos cérebros adultos após uma perseguição de pulso resultou em células expressas por GFP de membrana em vários nichos anatômicos. Deve-se notar a diferença na intensidade fluorescente entre vários tipos de células. Uma variável em relação à int…

Discussion

Um método para a criação, utilização e análise de uma linhagem transgênica tripla traçando células-tronco de marcação de camundongos dentro do cérebro de camundongo adulto in vivo é descrito. Quando combinado com imunostaining ou limpeza cerebral, a identificação e caracterização de células fluorescentes rastreadas em todo o cérebro podem ser realizadas. Esta técnica oferece a capacidade de entender o potencial plástico/regenerativo/remodelação das células-tronco rotuladas à medida que a…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx