成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

Summary

使用诱导的转基因谱系追踪小鼠系，用荧光团永久标记干细胞及其后代的能力允许对 体内的活化，增殖，迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预的反应和多能性的新信息。

Abstract

开发了一种端粒酶逆转录酶（Tert）谱系追踪小鼠系，通过将“Tet-On”系统oTet-Cre小鼠与与Tert启动子相关的新型反向四环素转激活剂（rtTA）转基因杂交，研究成体组织干细胞的行为和命运，我们已经证明这是一种新的成体脑干细胞群。在这里，向mTert-rtTA：：oTet-Cre小鼠施用四环素衍生物多西环素将不可磨灭地标记表达Tert基因启动子区域的4.4 kb片段的细胞群。当结合罗莎-mTmG报告基因时，在也表达特特的细胞中，多西环素处理诱导用膜EGFP（mGFP）取代多托马托表达。因此，当这些三重转基因谱系追踪小鼠接受多西环素（标记TERT表达细胞的“脉冲”期）时，这些细胞将变得不可磨灭地标记mGFP +细胞，即使在多西环素去除后（“追逐”期）可以跟踪任何理想的时间量，即使Tert表达随后丢失。然后将大脑灌注固定并处理为免疫荧光和其他下游应用，以解释干细胞活化，增殖，谱系承诺，迁移到各种脑壁以及分化成熟细胞类型的变化。使用该系统，任何rtTA小鼠都可以与oTet-Cre和Rosa报告基因交配，以使用干细胞标记进行多西环素诱导的“脉冲追逐”谱系追踪实验。

Introduction

谱系跟踪鼠标行的值
体内干细胞的分析可能很困难，因为许多检查这些细胞的测定只集中在动物死亡时表征这些细胞，这代表了时间上的最终快照。为了更好地了解祖细胞、中间/过渡细胞类型和成熟细胞随时间推移的增殖、分化和迁移过程，需要一种纵向分析方法。这可以通过谱系追踪研究来实现，其中干细胞/祖细胞被不可磨灭地标记，并且可以在之后的任何时间长度内跟踪¹。

在成年哺乳动物大脑中，首先通过胸腺嘧啶-H 3 2，3，⁴或5-溴-²‘-脱氧尿苷（BrdU）^5，6，7，⁸的标记保留来分析从干细胞和祖细胞产生成人出生的神经元的神经发生过程.在这些研究中，增殖细胞用胸腺嘧啶类似物标记，胸腺嘧啶类似物在复制和细胞分裂/增殖期间被掺入细胞的DNA中。因此，标记的细胞以及它们的后代包含这种类似物，然后在死后识别出来。然而，虽然胸苷-H³和BrdU允许在干细胞知之甚少的大脑区域中标记增殖细胞及其后代，但这些研究受到这些工具的缺点的阻碍。胸苷-H³诱导细胞周期停滞，细胞凋亡和剂量依赖性DNA合成抑制⁹，而BrdU根据给药途径¹⁰标记不同水平的细胞，并在修复或凋亡期间以及细胞分裂¹¹期间被细胞吸收。最近已经使用了更有效的标记方法，例如用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）标记，但许多与BrdU相同的问题仍然存在¹²。这些方法也有局限性，因为它们标记了任何增殖细胞，而不仅仅是干细胞，因此对结果的解释可能会混淆。在神经源性谱系中，所有干细胞和祖细胞都保留有丝分裂能力，只有终末/成熟神经元不增殖。对于星形胶质细胞和小胶质细胞，但不是少突胶质细胞，增殖无限期地维持^13，14，15。

因此，在研究干细胞及其后代时，转基因小鼠习惯于仅对表达感兴趣蛋白质的细胞进行谱系追踪，例如我们在这里使用的确认鉴定成体干细胞的细胞。虽然很难通过小鼠转基因方法产生，但谱系追踪小鼠品系允许追踪大脑中特定标记的细胞，并且不仅仅依赖于增殖。在Tet-On转基因小鼠系统中，施用四环素或多西环素（一种四环素衍生物）诱导使用反向四环素反式激活剂（rtTA）工程的细胞中的Cre-重组酶表达，该细胞由感兴趣的启动子转录。然后，Tet诱导的Cre驱动的重组将激活目标细胞中不可磨灭的荧光或发光蛋白的表达，这取决于所使用的Rosa报告小鼠。这些不可磨灭标记的细胞在分裂，分化或迁移后继续表达该报告基因，允许随着时间的推移或在不同干预之后跟踪这些细胞及其后代¹⁶。转基因谱系示踪方法的优点包括：1）追踪到RTTA标记的特定细胞谱系或祖细胞/干细胞的特异性，2）尽管细胞更新或分化，荧光或发光蛋白的不可磨灭表达，3）低毒性，4）在动物生命周期的任何一点有条件活化，以及5）易于使用常见测定， 包括免疫染色/免疫荧光¹⁶.

在小鼠中时间诱导报告工具的其他方法包括使用Cre-ERT2小鼠，其可以与ROSA-GFP，ROSA-mTmG或其他荧光报告基因转基因配对。在这些动物中，细胞特异性调节元件，例如感兴趣的启动子或增强子区域，驱动Cre重组酶的产生，其只能通过施用他莫昔 芬来激活 。虽然Cre-ERT2小鼠品系允许在特定细胞系中诱导Cre，但有大量知识详细介绍了他莫昔芬对成人神经发生的影响^17，18。此外，还有许多ROSA驱动的荧光报告基因可以代替GFP或mTmG，包括YFP或CFP，这将允许在其他荧光波长上进行交替荧光标记。这些荧光报告基因可与检测开启或 Cre-ERT2 系统一起使用。

端粒酶逆转录酶（TERT）是全酶端粒酶的限速组分，其在细胞分裂期间缩短端粒^19，20后起作用延长端粒。TERT已被确定为肠道^21，22，骨髓21^{，肝脏23，脂肪24}，子宫内膜^25，26和骨¹中成体组织干细胞的标志物。TERT在这些成体干细胞中的表达是仅用于端粒酶延伸活性还是执行非规范的TERT作用²⁷仍然是未知的。TERT表达的静止成体干细胞（qASCs）已被鉴定出来，并与转基因谱系追踪小鼠一起在全身进行追踪，以研究这些干细胞的多能性和自我更新能力，以及它们激活，增殖，分化和迁移的潜力^{1，22，23，28}。特-rtTA转基因的产生以前已经进行过¹。在本文中，我们将描述使用谱系追踪TERT小鼠系来研究TERT + qASCs，我们已经将其确定为成年小鼠大脑中的新型ASC群体。

转基因谱系追踪小鼠系的产生
要使用Tet-On系统生成谱系追踪小鼠谱系，必须通过小鼠交配在单个动物内组合三种转基因。第一种是rtTA，在目的基因的启动子的控制下表达（我们的是TERT-rtTA）。因此，在表达该目的基因的细胞中，rtTA将被表达。第二个是oTet-Cre基因，它含有四环素响应元件（TRE），该元件允许在rtTA融合转录本和四环素或多西环素存在的情况下转录Cre重组酶。四环素或多西环素 可以通过饮用水或 chow²⁹给予动物。最后，必须有一个基因将被Cre重组酶裂解激活。在这份手稿中，我们将描述的标记基因是Rosa26-mTmG基因，直到Cre重组之前，它将无处不在地转录mTomato（所有细胞中的膜红色荧光）。然而，如果一个细胞表达rtTA转录本并含有四环素或多西环素，则在mTomato和mGFP位点之间重组一组lox P位点的Cre重组将改变R26位点并导致细胞产生膜EGFP（mGFP或膜绿色荧光）而不是膜番茄。这种mGFP信号的不可磨灭性将允许在细胞增殖，迁移和分化时进行 体内 标记和追踪。在迹线之后，可以通过免疫荧光在标准冷冻切片或更厚的光学清除大脑中分析细胞的 GFP表达 。

在本文中，我们将描述特定小鼠线的使用，即为了创建这种三重转基因小鼠品系，我们首先将oTet-cre动物（杰克逊实验室菌株#006234）与罗莎-mTmG动物（杰克逊实验室菌株#007676）交配，以产生oTet-Cre：：Rosa-mTmG双转基因小鼠。用补充表1和2中指示的引物和PCR模板对这些动物进行基因分型。将小鼠（由大卫·布雷奥特¹创建）与oTet-cre：：罗莎-m-mG动物交配以产生图1B说明了鼠线的作用机制。

多西环素诱导和脉搏追逐设计
在计划实验时，重要的是要考虑将影响谱系追踪实验结果的几个因素，包括多西环素诱导时动物的年龄，多西环素给药的长度（“脉冲”期），多西环素去除后组织收集前的时间长度（“追逐”期），以及这些过程中任何干预的时间。这些研究设计考虑因素对于在实验结束时了解标记细胞及其后代至关重要。该过程的第一步是确定动物感兴趣的年龄和多西环素给药的长度。更长的脉冲周期将允许更多的细胞表达rtTA连接的启动子表达，并且更多的感兴趣的细胞被不可磨灭地标记。表现出目的基因瞬时表达的细胞类型可能需要比连续表达目的基因的细胞更长的脉冲周期。然而，如果研究的目标是了解感兴趣的细胞或急性干预的短期影响，则脉搏周期不能太长，因为一旦标记了细胞，它将在脉冲周期的剩余时间内通过任意数量的变化进行追踪。在我们的一些研究中，没有追逐期的2天脉冲被用来更接近地模仿TERT的直接报告者。这是因为Rosa-mTmG基因重组的最短时间为2天³¹。

脉搏追逐实验的下一个重要时期是去除多西环素和灌注动物之间的长度，也称为“追逐”。无论给药途径如何，多西环素在小鼠中的半衰期约为170分钟，从而得出结论，多西环素诱导可能在去除后数小时不再发生³²。然而，重要的是要注意，多西环素在老年小鼠中的代谢较慢，这可能导致比年轻动物更长的有效“脉冲”期³³。

在追逐期间，标记的细胞将继续被标记，即使在增殖，分化或迁移之后也是如此。这些细胞的后代也将被标记。该研究的目标将塑造脉冲追逐范式的长度。如果研究的目的是了解组织在很长一段时间内与目标细胞的再生，则可能需要很长的追逐期。最后，必须决定任何干预或治疗的时间。在脉冲期间施用将影响表达目的基因的细胞以及在此期间产生的任何后代，而在追逐期间施用可能主要影响目标细胞的后代，尽管这将取决于标记细胞分裂或分化的速度。 图2A概述了我们利用的脉冲追逐实验设计示例。

同样重要的是要注意由于表达泄漏而产生背景GFP信号的可能性。在没有多西环素的情况下，rtTA和Otet序列之间的固有结合电位以及在没有rtTA的情况下Otet转基因的残余活性（^在34中回顾）导致泄漏表达。渗漏表达代表了Tet系统的一个弱点，尽管泄漏通常是系统可接受的缺点，但泄漏表达可能导致毒性和死亡的情况，例如Otet-DTA动物中的白喉毒素（DTA）可以限制这些系统的使用³⁵。

用于显微镜检查的薄片的脑处理、切片和免疫荧光
为了在谱系追踪实验后分析小鼠的大脑，必须首先 通过 经心灌注来灌注小鼠，以去除可能导致大脑中高自发荧光的血液和脑脊液。动物可能灌注两种常用的固定剂：组织回旋组织固定剂，乙二醛固定剂（GF）或4%多聚甲醛（PFA）。乙二醛固定剂允许相对温和的固定过程，交联比PFA少。这降低了组织僵硬，减少了抗原检索的需求，并允许在免疫染色过程中较少浓缩的抗体溶液。然而，如果它们含有甲醇，这可能有助于增加自发荧光³⁶。另一方面，PFA通常允许更健壮的固定，虽然在免疫染色过程中需要抗原检索，但有些抗体只能与PFA固定的组织一起工作，并且需要灌注4%PFA用于后面描述的光学清除技术。

灌注后是注固后的步骤，其中大脑浸入灌注过夜期间使用的相同类型的固定剂中。这允许任何在灌注过程中可能尚未完全固定的大脑区域继续修复。接下来，大脑将在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的蔗糖中孵育，以在冷冻步骤之前除去尽可能多的水，以防止组织内结冰（“冷冻保存”）。然后，可以将大脑切成任意数量的矢状、冠状或横向组织切片进行处理。为了提高精度和可重复性，需要以一种确保动物之间一致的切割方式使用校准的脑块。可以影响大脑如何分割的最重要因素是感兴趣的大脑区域。例如，虽然矢状切口可能允许在一个组织切片中分析更多的脑区域，但这种切口将不允许分析心室下区（V-SVZ）的神经/胶质区域，因为外侧心室的外侧和内侧在该维度上无法识别，并且在冠状平面上可以更好地观察到。这可能是成人神经发生研究中要做出的重要区分，因为外侧心室的侧侧包含神经源性V-SVZ，而侧脑室的内侧壁是更强的胶质生态位³⁷。

将组织分成冠状，矢状或横截面后，使用最佳冷却温度（OCT）包埋溶液将其冷冻成块。在这里，大脑被冻结在这种嵌入材料中，使用干冰和乙醇的混合物。如果需要薄片分析，则块将在低温恒温器上切片，并且根据所需的下游分析，可以作为薄片（<20μm）粘附在带正电的载玻片上。也可以使用未带电的载玻片，但使用未带电的载玻片可能导致组织从载玻片³⁸中脱陷。如果需要中等厚度的自由漂浮组织切片（>20μm），组织将被收集为自由浮动切片。如果需要厚切片（0.5-4 mm），则需要使用振动切片机切割非冷冻脑切片。重要的是要注意载玻片上各部分之间的储存差异，这些切片需要在-20至-80°C下冷冻，而自由漂浮的部分则需要在4°C下储存。

脑清除和全山免疫荧光共聚焦显微镜检查
如果需要对小鼠大脑中的谱系追踪细胞进行更广泛但不太详细的分析，则可以使用iDISCO脑清除³⁹ 对较厚的脑组织片段进行全面分析，然后进行免疫染色和平铺z-stack共聚焦显微镜或光片显微镜检查。在这里，小鼠大脑的大部分将被光学清除（脱脂过程³⁹），这更好地允许在1毫米的组织切片上进行荧光信号成像。该过程的缺点是高自发荧光，并且由于与更传统的方法（薄冷冻切片或自由浮动切片）相比所需的工作距离增加，因此获得高分辨率细胞形态图像和详细共染色分析的能力降低。出于这个原因，我们建议大脑清除来分析整个大脑区域的大规模谱系追踪结果，而不是试图表征或分析单个细胞。

Protocol

这里描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。 1. 创建系谱系追踪Tet-On小鼠系，育种策略和实验队列小鼠的基因分型 注意：在这里，我们概述了使用Rosa-mTmG作为经历Cre重组的荧光报告基因的Tet-On小鼠系统的创建，但是其他各种Cre-重组驱动的报告基因系也可以与Tet-On系统一起使用。 将一只雌?…

Representative Results

虽然由具有荧光报告基因的Tet-On系统产生的荧光信号将根据感兴趣的启动子和所使用的荧光团而变化，但我们将描述如何使用mTert-rtTA：：oTet-Cre：：Rosa-mTmG动物分析结果。在脉搏追逐后对成人大脑的分析导致膜GFP表达细胞遍布各种解剖学壁龛。必须注意各种细胞类型之间荧光强度的差异。关于荧光强度的一个变量是细胞膜的大小。例如，脉络丛中的脉络膜上皮细胞（CPECs）具有厚厚的细胞膜和强?…

Discussion

描述了一种在体内创建、利用和分析在成年小鼠脑内标记干细胞的三重转基因谱系追踪小鼠系的方法。当与免疫染色或脑清除相结合时，可以完成整个大脑中追踪荧光细胞的鉴定和表征。该技术提供了了解标记干细胞在激活，迁移，分化或增殖时的可塑性/再生/重塑潜力的能力。虽然以前通过胸腺嘧啶-H³和BrdU的标签保留获得的数据得出结论，V-SVZ，嗅球和齿状回的晶下区域是…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx