यह प्रोटोकॉल माउस वसा डिपो के विच्छेदन और एंडोथेलियल सेल आबादी को मुक्त करने और फिर पहचानने के लिए संबंधित धमनियों के अलगाव और पाचन के लिए एक विधि का विवरण देता है। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग की जाने वाली ताजा पृथक कोशिकाएं संवहनी कोशिका जीव विज्ञान और संवहनी शिथिलता के तंत्र की समझ को आगे बढ़ाएंगी।
संवहनी प्रणाली की दीवार को अस्तर करने वाली संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जिसमें संवहनी टोन विनियमन, बाधा कार्य और एंजियोजेनेसिस शामिल हैं। एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन गंभीर कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों की प्रगति के लिए एक हॉलमार्क प्रेडिक्टर और प्रमुख चालक है, फिर भी अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में आते हैं। अपने मूल रूप में विभिन्न संवहनी बिस्तरों से एंडोथेलियल कोशिकाओं पर विश्लेषण करने की क्षमता हृदय रोग की प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगी। यह प्रोटोकॉल माउस चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक वसा ऊतकों के विच्छेदन के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, इसके बाद उनके संबंधित धमनी वाहिका का अलगाव होता है। पृथक धमनियों को तब पाचन एंजाइमों के एक विशिष्ट कॉकटेल का उपयोग करके पचाया जाता है जो कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने पर केंद्रित होता है। पचे हुए ऊतक का मूल्यांकन सकारात्मक एंडोथेलियल सेल पहचान के लिए मार्कर के रूप में सीडी 31 + / सीडी 45 – कोशिकाओं का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा किया जाता है। कोशिकाओं को तत्काल डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है या प्राथमिक सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न संवहनी बिस्तरों से धमनियों को अलग करने और पचाने की तकनीक शोधकर्ताओं को रुचि की धमनियों से ताजा पृथक संवहनी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकल्प प्रदान करेगी और उन्हें विशिष्ट सेल प्रकारों पर कार्यात्मक परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला करने की अनुमति देगी।
एंडोथेलियल कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं में उनकी महत्वपूर्ण भूमिकाओं के लिए अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है, जिसमें बाधा कार्य, एंजियोजेनेसिस और संवहनी टोन विनियमन 1,2 शामिल हैं। यद्यपि एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन एथेरोस्क्लेरोसिस, उच्च रक्तचाप, मधुमेह आदि को बढ़ावा देने में अच्छी तरह से प्रलेखित है, एंडोथेलियल डिसफंक्शन को चलाने वाले अंतर्निहित तंत्र खराब समझ में आते हैं और संभवतः अलग-अलग संवहनी बेड 2,3,4 के बीच भिन्न होते हैं। एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन के इन पैथोलॉजिकल तंत्रों को उजागर करने के प्रयास को ऊतकों से एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्ध आबादी तक सीमित पहुंच और / या संस्कृति 5,6 में एंडोथेलियल कोशिकाओं के फेनोटाइपिक परिवर्तनों द्वारा चुनौती दी जाती है। इसलिए, अपने मूल रूप में विभिन्न संवहनी बिस्तरों से एंडोथेलियल कोशिकाओं पर विश्लेषण करने में सक्षम होने से हृदय रोग की प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि मिलेगी।
यह प्रोटोकॉल चूहों से चमड़े के नीचे और मेसेन्टेरिक वसा ऊतकों को विच्छेदित करने की प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, इसके बाद उनके संबंधित धमनी वाहिका का अलगाव होता है। धमनी की दीवारों को अस्तर करने वाली कार्यात्मक रूप से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को एंजाइमों के एक विशिष्ट कॉकटेल का उपयोग करके मुक्त किया जाता है। विश्लेषण के लिए बायोमोलेक्यूलर मार्करों को बरकरार रखते हुए <1 मिलीग्राम शुरुआती ऊतक से एंडोथेलियल कोशिकाओं की पर्याप्त उपज प्राप्त करने के लिए पाचन प्रोटोकॉल की स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए विशेष ध्यान रखा गया था। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान की जाती है। सीडी 31 (पीईसीएएम) की उपस्थिति का उपयोग मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। अन्य सेल प्रकारों में सीडी 31 की अभिव्यक्ति के कारण, जिसमें कई हेमटोपोइएटिक मूल शामिल हैं जो सीडी 45 को भी व्यक्त करते हैं, अलग-थलग एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता को सीडी 31 और सीडी 45 5,6,7,8 दोनों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के बहिष्करण से और बढ़ाया गया था। इसके अलावा, अनुसंधान प्रश्न और नियोजित किए जाने वाले डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के आधार पर, शोधकर्ताओं को रुचि की सेल आबादी की शुद्धता को अनुकूलित करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक चयन मार्करों के एक व्यापक पैनल का चयन करने पर विचार करना चाहिए।
हालांकि एडीपोज डिपो धमनियों को विच्छेदित करने और अलग करने की तकनीक का उपयोग पिछलेप्रकाशनों 9,10,11,12,13 में किया गया है, एम्बेडेड धमनियों के अलगाव का वर्णन करने वाला एक विस्तृत प्रोटोकॉल अभी तक प्रस्तुत नहीं किया गया है। रुचि की किसी दी गई प्रजाति से विभिन्न संवहनी बिस्तरों से धमनियों के अलगाव और पाचन के लिए तकनीक का प्रदर्शन शोधकर्ताओं को रुचि की धमनियों से ताजा पृथक संवहनी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकल्प प्रदान करेगा और उन्हें विशिष्ट सेल प्रकारों पर कार्यात्मक परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला करने की अनुमति देगा। परीक्षणों में सेल सॉर्टिंग और झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति 5,8 के लिए फ्लो साइटोमेट्री, आयन चैनल गतिविधि9 के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक प्रोफाइलिंग (प्रोटिओमिक्स / जीनोमिक विश्लेषण, आदि) शामिल हो सकते हैं लेकिन सीमित नहीं हैं। 14,15, और विट्रो 16,17 में दवा स्क्रीनिंग के लिए प्राथमिक सेल लाइनों की पीढ़ी।
एंडोथेलियल डिसफंक्शन गंभीर रोग अवस्थाओं का अग्रदूत है, संभवतः एथेरोस्क्लेरोसिस, उच्च रक्तचाप और स्ट्रोक3,23 के विकास को चलाता है। जबकि किसी दिए गए पैथोलॉजिकल स्थिति में एंडोथेलियल डिसफंक्शन अंतर्निहित पहचाने गए तंत्र कई हैं, अलग-अलग संवहनी बेड पैथोलॉजिकल स्थितियों4,24 से अलग-अलग प्रभावित होने की संभावना है। इसके अलावा, विभिन्न कार्डियोवैस्कुलर जोखिम कारक (जैसे, मोटापा, उच्च रक्तचाप, डिस्लिपिडेमिया, धूम्रपान, मधुमेह) विभिन्न प्रकार के अलग-अलगतंत्रों के माध्यम से शिथिलता को प्रेरित करते हैं। इसलिए, एंडोथेलियल सेल आबादी को बीमारी या सुलभ मानव ऊतक के स्थापित पशु मॉडल से अलग करना और विवो वातावरण से तुरंत हटाई गई कोशिकाओं पर परख करना महत्वपूर्ण है। इस तरह से कोशिकाओं को अलग करने से संस्कृति में कोशिकाओं का अध्ययन करने पर एक अनूठा लाभ होता है जिसमें वे संस्कृति-प्रेरित फेनोटाइपिकपरिवर्तनों से शून्य होते हैं 5,6. इसके अलावा, एक हेटेरोजेनस एंडोथेलियल सेल आबादी सहित, जैसा कि विवो26,27 में देखा गया है (और इसे प्रवाह-सहायता प्राप्त सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अलग किया जा सकता है), एक जीवित जीव से विवो वातावरण में बेहतर जानकारी देता है। अंत में, यह विधि कई पशु मॉडल और संभावित रूप से मानव ऊतक की जांच पर लागू होती है और इसका उपयोग प्राथमिक सेल संस्कृति लाइनों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, अगर ऐसी आवश्यकता की आवश्यकता होती है।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम, और वह कदम जिसे विभिन्न संवहनी बिस्तरों या सेल प्रकारों के लिए सबसे अधिक समायोजित करने की आवश्यकता होगी, यहां प्रस्तुत नहीं किया गया है, संवहनी ऊतक का पाचन है। इस कदम को सेल उपज को कम किए बिना सेल स्वास्थ्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट एंजाइम और पाचन की अवधि सेल स्वास्थ्य और उपज को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं ताकि डाउनस्ट्रीम परख को पर्याप्त रूप से करने में सक्षम हो सकें। सीडी 36 की झिल्ली अभिव्यक्ति की पहचान के लिए, जैसा कि चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक एंडोथेलियल कोशिकाओं (चित्रा 4) में फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया था, पाचन प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण मूल रूप से पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी28 के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसमें फ्लो साइटोमेट्री बनाम पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए आवश्यक मांगों को बेहतर ढंग से पूरा करने के लिए सेल पैदावार बढ़ाने के लिए कोलेजनेज आई पाचन समय का विस्तार 30 मिनट तक शामिल था। चूंकि यह संशोधन कुछ हद तक सेल स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण में एक सेल व्यवहार्यता दाग का उपयोग किया गया था कि इस प्रोटोकॉल के बाद केवल व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 3)। यह अनुशंसा की जाती है कि संवहनी ऊतक से कोशिकाओं को अलग करने के उद्देश्य से अध्ययन में वांछित दृष्टिकोण का आकलन करने से पहले सेल व्यवहार्यता के लिए एक मार्कर शामिल होना चाहिए।
वर्णित प्रोटोकॉल चूहों से प्राप्त ≤1 मिलीग्राम धमनी नमूनों से विश्लेषण और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए पर्याप्त है; हालांकि, यदि रुचि की धमनियों को विभिन्न ऊतकों या जीवों (जैसे, मनुष्यों) से अलग किया जाना था, जिसके परिणामस्वरूप काफी अलग धमनी द्रव्यमान होंगे, तो किसी को पाचन एंजाइम सामग्री और इनक्यूबेशन की अवधि को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए अनुकूलित करना होगा। कुछ संवहनी बिस्तरों के लिए जो यहां प्रस्तुत चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक बेड (जैसे, कोरोनरी धमनियों) की तुलना में शुरुआती ऊतक की छोटी मात्रा से शुरू होते हैं, प्रति नमूने कई चूहों से धमनियों की पूलिंग आवश्यक हो सकती है। दरअसल, यह किसी भी संवहनी बिस्तर के लिए एक आवश्यक कदम हो सकता है, यह देखते हुए कि परिणाम दृष्टिकोण के लिए अपेक्षाकृत उच्च सेल उपज की आवश्यकता होती है। एक बड़ी सीमा यह है कि, प्रति नमूना पाचन में भिन्नता की प्रकृति के कारण, सेल पैदावार कभी-कभी एक ही संवहनी बिस्तर से होने पर भी बैचों में काफी भिन्न हो सकती है। यह डेटा का विश्लेषण करते समय समस्याएं पैदा कर सकता है और उचित होने पर सामान्यीकरण के माध्यम से इसका हिसाब रखा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक वसा धमनियों के अलग-अलग नमूनों में सेल पैदावार में परिवर्तन के कारण कच्चे डेटा में सीडी 36 अभिव्यक्ति बेहद परिवर्तनशील थी। इसलिए, कच्चे डेटा को सीडी 31 + सीडी 45 − औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था, इस धारणा के साथ कि यह विधि बैच मतभेदों के लिए सही होगी (चित्रा 4)। बेशक, दृष्टिकोण के आधार पर, अधिक परिष्कृत सांख्यिकीय विश्लेषण और सामान्यीकरण विधियों की आवश्यकता हो सकती है।
सारांश में, यह पेपर रुचि के एंडोथेलियल लक्ष्यों की अभिव्यक्ति और / या कार्य की जांच करने के लिए चूहों से चमड़े के नीचे और मेसेंटेरिक धमनियों को विच्छेदित करने, अलग करने और पचाने की एक विधि प्रस्तुत करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधन के साथ, विभिन्न संवहनी बिस्तर और सेल प्रकार (जैसे, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं) की जांच की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल, उपलब्ध प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों की अधिकता के लिए एक नींव के रूप में, संवहनी कोशिका जीव विज्ञान और संवहनी शिथिलता के तंत्र की समझ को आगे बढ़ाने की क्षमता रखता है।
The authors have nothing to disclose.
रिच वेस्ट की प्यार भरी याद में, एक शानदार वैज्ञानिक, सहयोगी और प्रिय दोस्त। हम डेलावेयर फ्लो साइटोमेट्री और बायोइमेजिंग कोर विश्वविद्यालय को हमारे अध्ययन में उनके चल रहे योगदान के लिए डेलावेयर जैव प्रौद्योगिकी संस्थान के हिस्से के रूप में धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पांडुलिपि की सावधानीपूर्वक समीक्षा और संपादन के लिए एम्मा हडगिन्स को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हमारा काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज पी 20जीएम 113125-6564 (आईएस फैन्चर) द्वारा समर्थित है। इस परियोजना को डेलावेयर INBRE कार्यक्रम द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसमें राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और डेलावेयर राज्य (आईएस फैन्चर) से NIGMS (P20GM103446) और डेलावेयर जनरल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (आईएस फैन्चर) के अनुदान के साथ। यह सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |