Este protocolo detalla un método para la disección de depósitos adiposos de ratón y el aislamiento y la digestión de las arterias respectivas para liberar y luego identificar la población de células endoteliales. Las células recién aisladas utilizadas en aplicaciones posteriores avanzarán en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.
Las células endoteliales vasculares que recubren la pared del sistema vascular desempeñan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos, incluida la regulación del tono vascular, las funciones de barrera y la angiogénesis. La disfunción de las células endoteliales es un predictor distintivo y un importante impulsor de la progresión de las enfermedades cardiovasculares graves, sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo poco conocidos. La capacidad de aislar y realizar análisis en células endoteliales de varios lechos vasculares en su forma nativa dará una idea de los procesos de la enfermedad cardiovascular. Este protocolo presenta el procedimiento para la disección de tejidos adiposos subcutáneos y mesentéricos de ratón, seguido del aislamiento de su respectiva vasculatura arterial. Las arterias aisladas se digieren utilizando un cóctel específico de enzimas digestivas centradas en liberar células endoteliales funcionalmente viables. El tejido digerido se evalúa mediante análisis de citometría de flujo utilizando células CD31+/CD45− como marcadores para la identificación positiva de células endoteliales. Las células se pueden clasificar para ensayos funcionales posteriores inmediatos o se pueden usar para generar líneas celulares primarias. La técnica de aislar y digerir arterias de diferentes lechos vasculares proporcionará opciones para que los investigadores evalúen células vasculares recién aisladas de arterias de interés y les permitirá realizar una amplia gama de pruebas funcionales en tipos específicos de células.
Las células endoteliales son bien reconocidas por su importante papel en una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo funciones de barrera, angiogénesis y regulación del tono vascular 1,2. Aunque la disfunción de las células endoteliales está bien documentada en la promoción de la aterosclerosis, la hipertensión, la diabetes, etc., los mecanismos subyacentes que impulsan la disfunción endotelial siguen siendo poco conocidos y probablemente difieren entre los distintos lechos vasculares 2,3,4. El esfuerzo por desentrañar estos mecanismos patológicos de disfunción de las células endoteliales es desafiado por el acceso limitado a una población pura de células endoteliales de los tejidos y/o los cambios fenotípicos de las células endoteliales en cultivo 5,6. Por lo tanto, ser capaz de aislar y realizar análisis en células endoteliales de varios lechos vasculares en su forma nativa dará una idea de los procesos de la enfermedad cardiovascular.
Este protocolo presenta el procedimiento para diseccionar tejidos adiposos subcutáneos y mesentéricos de ratones, seguido del aislamiento de su respectiva vasculatura arterial. Las células endoteliales funcionalmente viables que recubren las paredes arteriales se liberan utilizando un cóctel específico de enzimas. Se tuvo especial cuidado en optimizar las condiciones del protocolo de digestión para obtener un rendimiento suficiente de células endoteliales a partir de <1 mg de tejido de partida, manteniendo intactos los marcadores biomoleculares para su análisis. Las células endoteliales aisladas se identifican a continuación mediante citometría de flujo. La presencia de CD31 (PECAM) se utiliza principalmente para identificar células endoteliales. Debido a la expresión de CD31 en otros tipos de células, incluyendo varias de origen hematopoyético que también expresan CD45, la pureza de las células endoteliales aisladas se mejoró aún más por la exclusión de las células que expresan CD31 y CD45 5,6,7,8. Además, dependiendo de la pregunta de investigación y las aplicaciones posteriores que se emplearán, los investigadores deben considerar la selección de un panel extenso de marcadores de selección positivos y negativos para optimizar la pureza de la población celular de interés.
Aunque la técnica de disección y aislamiento de las arterias adiposas del depósito se ha utilizado en las publicaciones anteriores 9,10,11,12,13, aún no se ha presentado un protocolo detallado que describa el aislamiento de las arterias incrustadas. La demostración de la técnica para el aislamiento y la digestión de arterias de diferentes lechos vasculares de una especie de interés dada proporcionará opciones para que los investigadores evalúen células vasculares recién aisladas de arterias de interés y les permitirá realizar una amplia gama de pruebas funcionales en tipos de células específicas. Las pruebas pueden incluir, entre otras, citometría de flujo para clasificación celular y expresión de proteínas de membrana5,8, electrofisiología para la actividad del canal iónico9, perfil molecular (análisis proteómicos / genómicos, etc.) 14,15, y la generación de líneas celulares primarias para el cribado de fármacos in vitro16,17.
La disfunción endotelial es un precursor de estados de enfermedad graves, lo que probablemente impulsa el desarrollo de aterosclerosis, hipertensión y accidente cerebrovascular 3,23. Si bien los mecanismos identificados que subyacen a la disfunción endotelial en una condición patológica dada son muchos, es probable que los distintos lechos vasculares estén influenciados diferencialmente por condiciones patológicas 4,24. Además, diferentes factores de riesgo cardiovascular (por ejemplo, obesidad, hipertensión, dislipidemia, tabaquismo, diabetes) inducen disfunción a través de una variedad de mecanismos distintos23,25. Por lo tanto, es fundamental aislar las poblaciones de células endoteliales de modelos animales establecidos de enfermedad o tejido humano accesible y realizar ensayos en células inmediatamente eliminadas del entorno in vivo. Aislar las células de esta manera tiene una ventaja única sobre el estudio de células en cultivo, ya que están desprovistas de cambios fenotípicos inducidos por el cultivo 5,6. Además, la inclusión de una población de células endoteliales heterogéneas, como se observa in vivo 26,27 (y que puede separarse aún más mediante la clasificación celular asistida por flujo), de un organismo vivo informa mejor el entorno in vivo. Finalmente, este método es aplicable a la investigación de numerosos modelos animales y potencialmente tejido humano y puede usarse para generar líneas de cultivo celular primario, si tal necesidad está justificada.
El paso crítico en este protocolo, y el paso que más necesitará ajustarse para diferentes lechos vasculares o tipos de células no presentados aquí, es la digestión del tejido vascular. Este paso debe optimizarse para la salud celular sin disminuir el rendimiento celular. Las enzimas específicas utilizadas y la duración de la digestión son fundamentales para optimizar la salud celular y el rendimiento para poder realizar adecuadamente los ensayos posteriores. Para la identificación de la expresión membrana de CD36, detectada por citometría de flujo en células endoteliales subcutáneas y mesentéricas (Figura 4), se desarrolló una versión modificada del protocolo de digestión diseñado originalmente para la electrofisiología patch-clamp28 . Esto incluyó una extensión del tiempo de digestión de la colagenasa I a 30 minutos para aumentar los rendimientos celulares para satisfacer mejor las demandas de citometría de flujo en comparación con lo que se requiere para los estudios de parche y pinza. Como esta modificación puede afectar la salud celular hasta cierto punto, se utilizó una tinción de viabilidad celular en los análisis de citometría de flujo para garantizar que solo se evaluaran las células endoteliales viables siguiendo este protocolo (Figura 3). Se recomienda que los estudios dirigidos a aislar células del tejido vascular incluyan un marcador de viabilidad celular antes de evaluar el enfoque deseado.
El protocolo descrito es suficiente para liberar células endoteliales viables para análisis y aplicaciones posteriores a partir de muestras arteriales de ≤1 mg derivadas de ratones; Sin embargo, si las arterias de interés se aislaran de diferentes tejidos u organismos (por ejemplo, humanos) que resultarían en masas arteriales significativamente diferentes, uno tendría que optimizar el contenido de enzimas digestivas y la duración de la incubación para aislar eficientemente la población celular de interés. Para algunos lechos vasculares que comienzan con cantidades aún más pequeñas de tejido inicial que los lechos subcutáneos y mesentéricos presentados aquí (por ejemplo, arterias coronarias), puede ser necesario agrupar las arterias de varios ratones por muestra. De hecho, este puede ser un paso necesario para cualquier lecho vascular dado, dado que el enfoque de resultado requiere un rendimiento celular relativamente alto. Una limitación importante es que, debido a la naturaleza de las variaciones por digestión de la muestra, los rendimientos celulares a veces pueden ser significativamente diferentes entre lotes, incluso cuando provienen del mismo lecho vascular. Esto puede causar problemas al analizar datos y debe tenerse en cuenta a través de la normalización cuando corresponda. Por ejemplo, la expresión de CD36 fue extremadamente variable en los datos brutos debido a alteraciones en los rendimientos celulares en muestras individuales de arterias adiposas subcutáneas y mesentéricas. Por lo tanto, los datos brutos se normalizaron a la intensidad media de fluorescencia CD31 + CD45− con la suposición de que este método corregiría las diferencias de lote (Figura 4). Por supuesto, dependiendo del enfoque, es posible que se requieran análisis estadísticos más sofisticados y métodos de normalización.
En resumen, este artículo presenta un método para diseccionar, aislar y digerir arterias subcutáneas y mesentéricas de ratones para investigar la expresión y / o función de objetivos endoteliales de interés. Con modificaciones al protocolo presentado, se pueden investigar diferentes lechos vasculares y tipos de células (por ejemplo, células musculares lisas). Este protocolo, como base para una gran cantidad de enfoques experimentales disponibles, tiene el potencial de avanzar en la comprensión de la biología celular vascular y los mecanismos de la disfunción vascular.
The authors have nothing to disclose.
En memoria amorosa de Rich West, un brillante científico, colega y querido amigo. Nos gustaría agradecer a la Universidad de Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core como parte del Instituto de Biotecnología de Delaware por sus continuas contribuciones a nuestros estudios. También nos gustaría agradecer a Emma Hudgins por la cuidadosa revisión y edición del manuscrito. Nuestro trabajo está respaldado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Este proyecto también fue apoyado por el programa INBRE de Delaware, con una subvención del NIGMS (P20GM103446) de los Institutos Nacionales de Salud y el Estado de Delaware (I.S. Fancher), y una beca de Investigación de la Universidad General de Delaware (I.S. Fancher). Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |