Bu protokol, fare yağ depolarının diseksiyonu ve endotel hücre popülasyonunu serbest bırakmak ve daha sonra tanımlamak için ilgili arterlerin izolasyonu ve sindirimi için bir yöntemi detaylandırır. Aşağı akış uygulamalarında kullanılan taze izole edilmiş hücreler, vasküler hücre biyolojisinin ve vasküler disfonksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletecektir.
Vasküler sistemin duvarını kaplayan vasküler endotel hücreleri, vasküler ton regülasyonu, bariyer fonksiyonları ve anjiyogenez dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Endotel hücre disfonksiyonu, ciddi kardiyovasküler hastalıkların ilerlemesi için ayırt edici bir belirleyici ve ana itici güçtür, ancak altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Endotel hücrelerini çeşitli vasküler yataklardan doğal formlarında izole etme ve analiz yapma yeteneği, kardiyovasküler hastalık süreçleri hakkında fikir verecektir. Bu protokol, fare subkutan ve mezenterik yağ dokularının diseksiyonu ve ardından ilgili arteriyel vaskülatürlerinin izolasyonu için prosedürü sunar. İzole arterler daha sonra fonksiyonel olarak canlı endotel hücrelerini serbest bırakmaya odaklanan belirli bir sindirim enzimi kokteyli kullanılarak sindirilir. Sindirilen doku, pozitif endotel hücre tanımlaması için belirteçler olarak CD31 + / CD45 hücreleri kullanılarak akış sitometrisi analizi ile değerlendirilir. Hücreler hemen aşağı akış fonksiyonel tahlilleri için sıralanabilir veya birincil hücre hatları oluşturmak için kullanılabilir. Arterleri farklı vasküler yataklardan izole etme ve sindirme tekniği, araştırmacıların yeni izole edilmiş vasküler hücreleri ilgilendikleri arterlerden değerlendirmeleri ve belirli hücre tipleri üzerinde çok çeşitli fonksiyonel testler yapmalarına izin vermesi için seçenekler sağlayacaktır.
Endotel hücreleri, bariyer fonksiyonları, anjiyogenez ve vasküler ton regülasyonu 1,2 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerdeki önemli rolleri ile iyi tanınmaktadır. Endotel hücre disfonksiyonu ateroskleroz, hipertansiyon, diyabet vb. yönde iyi belgelenmiş olmasına rağmen, endotel disfonksiyonunu tetikleyen altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve muhtemelen farklı vasküler yataklar arasında farklılık göstermektedir 2,3,4. Endotel hücre disfonksiyonunun bu patolojik mekanizmalarını çözme çabası, dokulardan saf bir endotel hücresi popülasyonuna sınırlı erişim ve / veya kültürdeki endotel hücrelerinin fenotipik değişiklikleri 5,6 ile karşı karşıya kalmaktadır. Bu nedenle, endotel hücrelerini çeşitli vasküler yataklardan doğal formlarında izole edebilmek ve analiz yapabilmek, kardiyovasküler hastalık süreçleri hakkında fikir verecektir.
Bu protokol, subkutan ve mezenterik yağ dokularını farelerden diseke etme prosedürünü ve ardından ilgili arteriyel vaskülatürlerinin izolasyonunu sunar. Arteriyel duvarları kaplayan fonksiyonel olarak canlı endotel hücreleri, spesifik bir enzim kokteyli kullanılarak serbest bırakılır. Analiz için biyomoleküler belirteçleri sağlam tutarken, <1 mg başlangıç dokusundan yeterli endotel hücresi verimi elde etmek için sindirim protokolünün koşullarını optimize etmek için özel dikkat gösterilmiştir. İzole endotel hücreleri daha sonra akış sitometrisi kullanılarak tanımlanır. CD31 (PECAM) varlığı öncelikle endotel hücrelerini tanımlamak için kullanılır. CD45'i de eksprese eden hematopoetik kökenli birkaç kişi de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinde CD31'in ekspresyonu nedeniyle, izole endotel hücrelerinin saflığı, hem CD31 hem de CD45 5,6,7,8’i eksprese eden hücrelerin dışlanmasıyla daha da artmıştır. Ayrıca, araştırma sorusuna ve kullanılacak aşağı akış uygulamalarına bağlı olarak, araştırmacılar, ilgilenilen hücre popülasyonunun saflığını optimize etmek için pozitif ve negatif seçim belirteçlerinden oluşan kapsamlı bir panel seçmeyi düşünmelidir.
Yağ deposu arterlerinin diseksiyonu ve izole edilmesi tekniği önceki yayınlarda 9,10,11,12,13 kullanılmış olmasına rağmen, gömülü arterlerin izolasyonunu tanımlayan ayrıntılı bir protokol henüz sunulmamıştır. Belirli bir ilgi türünden farklı vasküler yataklardan arterlerin izolasyonu ve sindirimi için tekniğin gösterilmesi, araştırmacıların ilgilenilen arterlerden taze izole edilmiş vasküler hücreleri değerlendirmeleri ve belirli hücre tipleri üzerinde çok çeşitli fonksiyonel testler yapmalarına izin vermesi için seçenekler sunacaktır. Testler, hücre sıralama ve membran protein ekspresyonu5,8 için akış sitometrisi, iyon kanalı aktivitesi için elektrofizyoloji9, moleküler profilleme (proteomik / genomik analizler, vb.) içerebilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. 14,15 ve in vitro ilaç taraması için birincil hücre hatlarının oluşturulması 16,17.
Endotel disfonksiyonu, muhtemelen ateroskleroz, hipertansiyon ve inme gelişimini tetikleyen ciddi hastalık durumlarının öncüsüdür 3,23. Belirli bir patolojik durumda endotel disfonksiyonunun altında yatan tanımlanmış mekanizmalar çok sayıda olmakla birlikte, farklı vasküler yatakların patolojik durumlardan farklı şekilde etkilenmesi muhtemeldir 4,24. Ayrıca, farklı kardiyovasküler risk faktörleri (örneğin, obezite, hipertansiyon, dislipidemi, sigara, diyabet) çeşitli farklı mekanizmalarla disfonksiyona neden olur23,25. Bu nedenle, endotel hücre popülasyonlarını yerleşik hayvan hastalık modellerinden veya erişilebilir insan dokusundan izole etmek ve in vivo ortamdan derhal çıkarılan hücreler üzerinde tahliller yapmak çok önemlidir. Hücreleri bu şekilde izole etmek, kültürdeki hücreleri incelemeye göre benzersiz bir avantaja sahiptir, çünkü kültür kaynaklı fenotipik değişikliklerden yoksundurlar 5,6. Dahası, in vivo 26,27’de gözlendiği gibi heterojen bir endotel hücre popülasyonu da dahil olmak üzere (ve akış destekli hücre sıralama kullanılarak daha da ayrılabilir), canlı bir organizmadan in vivo ortamı daha iyi bilgilendirir. Son olarak, bu yöntem çok sayıda hayvan modelinin ve potansiyel olarak insan dokusunun araştırılması için geçerlidir ve böyle bir ihtiyaç garanti edilirse, birincil hücre kültürü hatları oluşturmak için kullanılabilir.
Bu protokoldeki kritik adım ve burada sunulmayan farklı vasküler yataklar veya hücre tipleri için en çok ayarlanması gereken adım, vasküler dokunun sindirimidir. Bu adım, hücre verimini azaltmadan hücre sağlığı için optimize edilmelidir. Kullanılan spesifik enzimler ve sindirim süresi, hücre sağlığını optimize etmek ve aşağı akış tahlillerini yeterince gerçekleştirebilmek için verim sağlamak için kritik öneme sahiptir. Subkutan ve mezenterik endotel hücrelerinde akış sitometrisi ile saptanan CD36’nın membran ekspresyonunun tanımlanması için (Şekil 4), başlangıçta yama-kelepçeli elektrofizyoloji28 için tasarlanmış sindirim protokolünün modifiye edilmiş bir versiyonu geliştirilmiştir. Bu, akış sitometrisinin taleplerini daha iyi karşılamak için hücre verimini artırmak için kollajenaz I sindirim süresinin 30 dakikaya uzatılmasını ve yama-kelepçe çalışmaları için gerekenleri içeriyordu. Bu modifikasyon hücre sağlığını bir dereceye kadar etkileyebileceğinden, bu protokolü takiben sadece canlı endotel hücrelerinin değerlendirilmesini sağlamak için akış sitometri analizlerinde bir hücre canlılığı boyası kullanılmıştır (Şekil 3). Hücreleri vasküler dokudan izole etmeyi amaçlayan çalışmaların, istenen yaklaşımı değerlendirmeden önce hücre canlılığı için bir belirteç içermesi önerilir.
Tanımlanan protokol, farelerden türetilen ≤1 mg arteriyel örneklerden analiz ve aşağı akış uygulamaları için canlı endotel hücrelerini serbest bırakmak için yeterlidir; Bununla birlikte, ilgilenilen arterler, önemli ölçüde farklı arteriyel kitlelerle sonuçlanacak farklı dokulardan veya organizmalardan (örneğin, insanlar) izole edilecekse, ilgilenilen hücre popülasyonunu verimli bir şekilde izole etmek için sindirim enzimi içeriğini ve kuluçka süresini optimize etmek gerekir. Burada sunulan deri altı ve mezenterik yataklardan (örneğin, koroner arterler) daha az miktarda başlangıç dokusu ile başlayan bazı vasküler yataklar için, örnek başına birkaç fareden arterlerin havuzlanması gerekli olabilir. Aslında, sonuç yaklaşımının nispeten yüksek bir hücre verimi gerektirdiği göz önüne alındığında, bu herhangi bir vasküler yatak için gerekli bir adım olabilir. Önemli bir sınırlama, numune sindirimi başına varyasyonların doğası gereği, hücre verimlerinin bazen aynı vasküler yataktan bile partiler arasında önemli ölçüde farklı olabilmesidir. Bu, verileri analiz ederken sorunlara neden olabilir ve uygun olduğunda normalleştirme yoluyla hesaba katılmalıdır. Örneğin, CD36 ekspresyonu, deri altı ve mezenterik adipoz arterlerin bireysel örneklerinde hücre verimindeki değişiklikler nedeniyle ham verilerde son derece değişkendi. Bu nedenle, ham veriler, bu yöntemin parti farkları için düzelteceği varsayımıyla CD31 + CD45− ortalama floresan yoğunluğuna normalleştirildi (Şekil 4). Tabii ki, yaklaşıma bağlı olarak, daha sofistike istatistiksel analizler ve normalleştirme yöntemleri gerekebilir.
Özetle, bu yazıda endotel hedeflerinin ekspresyonu ve/veya fonksiyonunu araştırmak için farelerden subkutan ve mezenterik arterleri disseke etmek, izole etmek ve sindirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan protokolde yapılan değişikliklerle, farklı vasküler yataklar ve hücre tipleri (örneğin, düz kas hücreleri) araştırılabilir. Bu protokol, mevcut deneysel yaklaşımların bolluğunun temeli olarak, vasküler hücre biyolojisinin ve vasküler disfonksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletme potansiyeline sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Parlak bir bilim adamı, meslektaşı ve sevgili arkadaşı olan Rich West’in sevgi dolu anısına. Delaware Biyoteknoloji Enstitüsü’nün bir parçası olarak Delaware Üniversitesi Akış Sitometrisi ve BiyoGörüntüleme Çekirdeği’ne çalışmalarımıza devam eden katkıları için teşekkür ederiz. Ayrıca Emma Hudgins’e makalenin dikkatli bir şekilde gözden geçirilmesi ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalarımız Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20GM113125-6564 (I.S. Fancher) tarafından desteklenmektedir. Bu proje aynı zamanda Delaware INBRE programı tarafından, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti’nden (I.S. Fancher) NIGMS’den (P20GM103446) bir hibe ve Delaware Üniversitesi Genel Üniversitesi Araştırma hibesi (I.S. Fancher) ile desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |