Hi-C 3.0 er en forbedret Hi-C-protokol, der kombinerer formaldehyd og disuccinimidylglutarat tværbindinger med en cocktail af DpnII- og DdeI-restriktionsenzymer for at øge signal-støj-forholdet og opløsningen af kromatininteraktionsdetektion.
Kromosomkonformationsindfangning (3C) bruges til at detektere tredimensionelle kromatininteraktioner. Typisk bruges kemisk tværbinding med formaldehyd (FA) til at fiksere kromatininteraktioner. Derefter omdanner kromatinfordøjelse med et restriktionsenzym og efterfølgende religation af fragmentender tredimensionel (3D) nærhed til unikke ligeringsprodukter. Endelig, efter vending af tværbindinger, proteinfjernelse og DNA-isolering, skæres DNA og forberedes til sekventering med høj kapacitet. Hyppigheden af nærhedsligation af par loci er et mål for hyppigheden af deres colokalisering i tredimensionelt rum i en cellepopulation.
Et sekventeret Hi-C-bibliotek giver genom-dækkende information om interaktionsfrekvenser mellem alle par loci. Opløsningen og præcisionen af Hi-C er afhængig af effektiv tværbinding, der opretholder kromatinkontakter og hyppig og ensartet fragmentering af kromatinen. Dette papir beskriver en forbedret in situ Hi-C-protokol, Hi-C 3.0, der øger effektiviteten af tværbinding ved at kombinere to tværbindinger (formaldehyd [FA] og disuccinimidylglutarat [DSG]), efterfulgt af finere fordøjelse ved hjælp af to restriktionsenzymer (DpnII og DdeI). Hi-C 3.0 er en enkelt protokol til nøjagtig kvantificering af genomfoldningsfunktioner i mindre skalaer såsom sløjfer og topologisk associerende domæner (TAD’er) samt funktioner i større kernebrede skalaer såsom rum.
Kromosomkonformationsoptagelse er blevet brugt siden 20021. Grundlæggende er enhver konformationsindfangningsvariant afhængig af fiksering af DNA-protein og protein-protein-interaktioner for at bevare 3D-kromatinorganisation. Dette efterfølges af DNA-fragmentering, normalt ved restriktionsfordøjelse, og endelig slutter religation af nærliggende DNA for at omdanne rumligt proksimale loci til unikke kovalente DNA-sekvenser. Indledende 3C-protokoller brugte PCR til at prøve specifikke, “en-til-en” interaktioner. Efterfølgende 4C-assays tillod påvisning af “en-til-alle” interaktioner2, mens 5C detekterede “mange-til-mange” interaktioner3. Kromosomkonformationsfangst kom til fuld frugt efter implementering af næste generations high-throughput-sekventering (NGS), som tillod påvisning af “alt-til-alle” genomiske interaktioner ved hjælp af genom-dækkende Hi-C4 og sammenlignelige teknikker såsom 3C-seq5, TCC6 og Micro-C 7,8 (se også anmeldelse af Denker og De Laat9).
I Hi-C anvendes biotinylerede nukleotider til at markere 5′ udhæng efter fordøjelsen og før ligering (figur 1). Dette giver mulighed for udvælgelse af korrekt fordøjede og religerede fragmenter ved hjælp af streptavidinbelagte perler, hvilket adskiller det fra GCC10. En vigtig opdatering af Hi-C-protokollen blev implementeret af Rao et al.11, der udførte fordøjelsen og religationen i intakte kerner (dvs. in situ) for at reducere falske ligeringsprodukter. Desuden reducerede udskiftning af HindIII-fordøjelse med MboI (eller DpnII) fordøjelsen fragmentstørrelsen og øgede opløsningspotentialet for Hi-C. Denne stigning tillod påvisning af relativt små strukturer og en mere præcis genomisk lokalisering af kontaktpunkter, såsom DNA-sløjfer mellem små cis-elementer, f.eks. sløjfer mellem CTCF-bundne steder genereret af loopekstrudering11,12. Dette potentiale har dog en pris. For det første kræver en dobbelt stigning i opløsning en firedobling (22) stigning i sekventeringslæsninger13. For det andet øger de små fragmentstørrelser muligheden for at forveksle ufordøjede nabofragmenter med fordøjede og religerede fragmenter14. Som nævnt adskiller fordøjede og religerede fragmenter sig i Hi-C fra ufordøjede fragmenter ved tilstedeværelsen af biotin ved ligeringskrydset. Imidlertid kræves korrekt fjernelse af biotin fra uligerede ender for at sikre, at kun ligeringskryds trækkes ned14,15.
Med de faldende omkostninger ved NGS bliver det muligt at studere kromosomfoldning mere detaljeret. For at mindske størrelsen af DNA-fragmenter og derved øge opløsningen kan Hi-C-protokollen tilpasses til hyppigere skærerestriktionsenzymer16 eller til at anvende kombinationer af restriktionsenzymer17,18,19. Alternativt kan MNase 7,8 i Micro-C og DNase i DNase Hi-C20 titreres for at opnå optimal fordøjelse.
En nylig systematisk evaluering af de grundlæggende elementer i 3C-metoder viste, at detektionen af kromosomfoldningsfunktioner ved hver længdeskala blev stærkt forbedret med sekventiel tværbinding med 1% FA efterfulgt af 3 mM DSG17. Desuden var Hi-C med HindIII-fordøjelse den bedste mulighed for at detektere store foldefunktioner, såsom rum, og at Micro-C var overlegen til at detektere småskala foldefunktioner såsom DNA-sløjfer. Disse resultater førte til udviklingen af en enkelt “Hi-C 3.0”-strategi med høj opløsning, der anvender kombinationen af FA- og DSG-tværbindinger efterfulgt af dobbeltfordøjelse med DpnII- og DdeI-endonukleaser21. Hi-C 3.0 giver en effektiv strategi til generel brug, fordi den nøjagtigt registrerer foldefunktioner på tværs af alle længdeskalaer17. Den eksperimentelle del af Hi-C 3.0-protokollen er detaljeret her, og typiske resultater, der kan forventes efter sekventering, vises.
Figur 1: Hi-C-procedure i seks trin. Celler fastgøres først med FA og derefter DSG (1). Derefter går lysis forud for en dobbelt fordøjelse med DdeI og DpnII (2). Biotin tilsættes ved udhængsudfyldning, og proksimale stumpede ender ligeres (3) før DNA-oprensning (4). Biotin fjernes fra uligerede ender før sonikering og størrelsesvalg (5). Endelig giver pull-down af biotin mulighed for adapterligation og biblioteksforstærkning ved PCR (6). Forkortelser: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kritiske trin til cellehåndtering
Selvom det er muligt at bruge et lavere antal inputceller, er denne protokol optimeret til ~ 5 × 106 celler pr. sekventeringsbane (~ 400 M læser) for at sikre korrekt kompleksitet efter dyb sekventering. Celler tælles bedst inden fiksering. Til generering af ultradybe biblioteker multiplicerer vi generelt antallet af baner (og celler), indtil den ønskede læsedybde er nået. For at opnå optimal fiksering skal serumholdigt substrat erstattes med PBS før FA-fiksering, og fikseringsopløsninger skal tilsættes straks og uden koncentrationsgradienter15,22. Til cellehøst foretrækkes skrabning frem for trypsinisering, fordi overgangen fra en fladere til en sfærisk form efter trypsinisering kan påvirke den nukleare konformation. Efter tilsætning af DSG går løse og klumpede cellepiller let tabt. Vær forsigtig, når du håndterer celler på dette stadium, og tilføj op til 0,05% BSA for at mindske klumpning.
Ændringer af metoden
Denne protokol blev udviklet ved hjælp af humane celler17. Men baseret på erfaring med indfangning af kromosomkonformation bør denne protokol fungere for de fleste eukaryote celler. For et betydeligt lavere input (~ 1 × 106 celler) anbefaler vi at bruge halvdelen af volumenerne til lysis- og konformationsindfangningsprocedurerne [trin 2.1-2.4]. Dette ville også gøre det muligt at udføre DNA-isolering [trin 2.5] i en bordpladecentrifuge med 1,7 ml rør, hvilket kunne forbedre pelletering for lave DNA-koncentrationer. Kvantificeringen af DNA (trin 2.6.6) angiver, hvordan man skal forholde sig. For lave mængder isoleret DNA (1-5 μg) foreslår vi at springe over størrelsesvalget (trin 3.3) og fortsætte med fjernelse af biotin efter at have reduceret volumenet fra 130 μL til ~ 45 μL med en CFU.
Denne protokol blev udviklet specielt for at sikre data af høj kvalitet efter efterfølgende tværbinding med FA og DSG og fordøjelse med DpnII og DdeI. Imidlertid kan alternative tværbindingsstrategier såsom FA efterfulgt af EGS (ethylenglycolbis (succinimidylsuccinat)), som også anvendes i ChIP-seq23 og ChIA-PET24, fungere lige så godt17. Tilsvarende kan forskellige enzymkombinationer, såsom DpnII og HinfI18 eller MboI, MseI og NlaIII19 , anvendes til fordøjelsen. Når du tilpasser enzymkombinationer, skal du sørge for at bruge biotinylerede nukleotider, der kan udfylde de specifikke 5 ‘udhæng og bruge de mest optimale buffere til hver cocktail. DpnII leveres med sin egen buffer, og enzymproducenten anbefaler en specifik buffer til DdeI-fordøjelsen. Men for dobbeltfordøjelsen med DpnII og DdeI i denne protokol anbefales Restriction Buffer, fordi den er vurderet til 100% aktivitet for begge enzymer.
Fejlfinding af konformationsregistrering
De tre vigtigste trin i kromosomkonformationsfangst: tværbinding, fordøjelse og religation er alle blevet udført, før resultaterne kan visualiseres på gel. For at bestemme kvaliteten af hvert af disse tre trin og skelne, hvor der kunne være opstået problemer, tages og lægges aliquoter før (CI) og efter fordøjelsen (DC) på gelen sammen med den ligerede Hi-C-prøve (figur 2). Denne gel bruges til at bestemme kvaliteten af Hi-C-prøven, og om det vil være værd at fortsætte protokollen. Uden CI og DC er det vanskeligt at udpege potentielle suboptimale trin. Det er værd at bemærke, at suboptimal ligering kan skyldes et problem i selve ligeringen, udfyldningen eller et problem med tværbinding. Hvis du vil foretage fejlfinding af krydslinkning, skal du sørge for ikke at bruge mere end 1 × 107 celler pr. bibliotek og starte med friske tværbindingsreagenser og rene celler (dvs. skyllet med PBS). For ligering skal du sørge for, at celler og ligeringsblanding opbevares på is. Tilsæt T4 DNA-ligase lige før 4 timers inkubation ved 16 °C og bland godt.
Fejlfinding af biblioteksforberedelse
Hvis der er behov for mere end 10 PCR-cyklusser, eller der ikke kan ses noget PCR-produkt på gel efter PCR-titrering (figur 4), er der et par muligheder for at gemme Hi-C-prøven. Når man arbejder tilbage fra PCR-titreringen, er den første mulighed at prøve PCR igen. Hvis der stadig ikke er nok produkt, er det muligt at forsøge endnu en omgang A-tailing og adapterligering (trin 3.6) efter vask af perlerne to gange med 1x TLE buffer. Efter denne ekstra A-tailing og adapterligering kan man fortsætte til PCR-titreringen som før. Hvis der stadig ikke er noget produkt, er den sidste mulighed at resonere 0,8x fraktionen fra trin 3,3 og fortsætte derfra.
Begrænsninger og fordele ved Hi-C3.0
Det er vigtigt at indse, at Hi-C er en populationsbaseret metode, der fanger den gennemsnitlige hyppighed af interaktioner mellem par loci i cellepopulationen. Nogle beregningsanalyser er designet til at adskille kombinationer af konformationer fra en population25, men i princippet er Hi-C blind for forskelle mellem celler. Selvom det er muligt at udføre enkeltcelle Hi-C26,27, og beregningsmæssige slutninger kan foretages28, er enkeltcelle Hi-C ikke egnet til at opnå 3C-information med ultrahøj opløsning. En yderligere begrænsning af Hi-C er, at den kun registrerer parvise interaktioner. For at opdage multikontaktinteraktioner kan man enten bruge hyppige fræsere kombineret med kortlæst sekventering (Illumina)16 eller udføre multikontakt 3C29 eller 4C30 ved hjælp af langlæst sekventering fra PacBio- eller Oxford Nanopore-platforme. Hi-C-derivater til specifikt at detektere kontakter mellem og langs søsterkromatider er også blevet udviklet31,32.
Selvom Hi-C19 og Micro-C33 kan bruges til at generere kontaktkort ved subkilobaseopløsninger, kræver begge en stor mængde sekventeringslæsninger, og dette kan blive en dyr opgave. For at komme til lignende eller endnu højere opløsning uden omkostningerne kan berigelse for specifikke genomiske regioner (capture-C34) eller specifikke proteininteraktioner (ChiA-PET 35, PLAC-seq 36, Hi-ChIP37) anvendes. Styrken og ulempen ved disse berigelsesapplikationer er, at der kun udtages et begrænset antal interaktioner. Med sådanne berigelser går det globale aspekt af Hi-C (og muligheden for global normalisering) tabt.
Betydning og potentielle anvendelser af Hi-C3.0
Denne protokol blev designet til at muliggøre ultradeep 3C med høj opløsning, samtidig med at den registrerer store foldefunktioner såsom TAD’er og rum17 (figur 6). Denne protokol starter med 5 × 106 celler pr. rør for hvert Hi-C-bibliotek, hvilket skal være mere end nok materiale til at sekvensere en eller to baner på en flowcelle for at opnå op til 1 milliard parrede endelæsninger. Til ultradeep sekventering skal der fremstilles flere rør med 5 × 106 celler afhængigt af antallet af kortlagte læsninger og PCR-duplikater. Ved den højeste opløsning (<1 kb) findes looping-interaktioner for det meste mellem CTCF-websteder, men promotor-forstærkerinteraktioner kan også detekteres. Læsere kan henvise til Akgol Oksuz et al.17 for en detaljeret beskrivelse af dataanalysen.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Denis Lafontaine for protokoludvikling og Sergey Venev for bioinformatisk bistand. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health Common Fund 4D Nucleome Program til JD (U54-DK107980, UM1-HG011536). J.D. er en efterforsker af Howard Hughes Medical Institute.
Denne artikel er underlagt HHMI’s Open Access to Publications-politik. HHMI-laboratorieledere har tidligere givet en ikke-eksklusiv CC BY 4.0-licens til offentligheden og en underlicenserbar licens til HHMI i deres forskningsartikler. I henhold til disse licenser kan det forfatteraccepterede manuskript til denne artikel gøres frit tilgængeligt under en CC BY 4.0-licens umiddelbart efter offentliggørelsen.
1 kb Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU) | EMD Millipore | UFC500396 | |
Annealing Buffer (5x) | See recipe in supplemental materials | ||
ATP 10 mM | ThermoFisher | R0441 | |
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge | Beckman Coulter | ||
beckman ultracentrifuge tube 35 mL | Beckman Coulter | 357002 | |
Binding Buffer (2x) | See recipe in supplemental materials | ||
biotin-14-dATP 0.4 mM | Invitrogen | 19524-016 | |
BSA 10 mg/mL | New England Biolabs | B9000S | dilute from 20 mg/mL |
Cell scraper | Falcon | 353089 | |
Cell scraper | Corning | 3008 | |
Conical polypropylene tubes 50 mL | Denville | C1062-P | |
Conical tube 15 mL | Denville | C1017-P | |
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL | Covaris | 520045/520077 | |
Covaris Sonicator | Covaris | E220/E220evolution/M220 | |
Culture flask 175 cm2 | Falcon | 353112 | |
Culture plates 150 mm x 25 mm | Corning | 430599 | |
dATP 1 mM | Invitrogen | 56172 | |
dATP 10 mM | Invitrogen | 56172 | |
dCTP 10 mM | Invitrogen | 56173 | |
DdeI | New England Biolabs | R0175L | |
dGTP 10 mM | Invitrogen | 56174 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x10ML | |
dNTP mix 25 mM | Invitrogen | 10297117 | |
Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 8853010002/8853030002 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
DpnII | New England Biolabs | R0543M | |
DSG | ThermoScientific | 20593 | |
dTTP 10 mM | Invitrogen | 56175 | |
Ethanol 70% | Fisher | A409-4 | Diluted from 100% |
Ethidium Bromide | Fisher | BP1302-10 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher | BP531-500 | |
Gel loading dye (6x ) | New England Biolabs | B7024S | |
Glycine in ultrapure water 2.5 M | Sigma | G8898-1KG | |
HBSS | Gibco | 14025-092 | |
Igepal CA-630 detergent | MP Biomedicals | 198596 | |
Klenow DNA polymerase 5 U/µL | New England Biolabs | M0210L | |
Klenow Fragment 3–>5’ exo-, 5 U/µL | New England Biolabs | M0212L | |
ligation buffer (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
Liquid nitrogen | |||
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | |
Lysis buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Magnetic Particle separator | ThermoFisher | 12321D | |
Microfuge tubes 1.7 mL | Axygen | MCT-175-C | |
MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
NEBuffer 2.1 (10x) | New England Biolabs | B7002S | |
NEBuffer 3.1 (10x) | New England Biolabs | B7203S | |
PBS | Gibco | 70013-032 | |
PCR (strip) tubes | Biorad | TBS0201/ TCS0803 | |
PCR thermocycler | Biorad | T100 | |
Pfu Ultra II Buffer (10x) | Agilent | Comes with Pfu Ultra | |
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Agilent | 600674 | |
Phase lock tube 15 mL | Qiagen | 129065 | |
Phase lock tubes 2 mL | Qiagen | 129056 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher | 78440 | |
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL | Invitrogen | 25530-031 | |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL | Thermo Scientific | EN0531 | |
Rotator | Argos technologies | EW-04397-40 or rocking platform | |
SDS 1% | Fisher | BP13111 | |
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M | Sigma | ||
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704401 | |
T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 100004817 | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
T4 DNA polymerase 3 U/µL | New England Biolabs | M0203L | |
T4 ligation buffer (5x) | Invitrogen | Y90001 | |
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL | New England Biolabs | M0201L | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
TBE buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Tris Low EDTA Buffer (TLE) | See recipe in supplemental materials | ||
Triton X-100 (10%) | Sigma | 93443 | |
Truseq adapter oligos | Integrated DNA Technologies (IDT)) | https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | 250 nmole and HPLC purified |
Tween 20 detergent | Fisher | 9005-64-5 | |
Tween Wash Buffer | See recipe in supplemental materials | ||
Vortex | Scientific Industries | (G560)SI-0236 |