Fånga kromosomkonformation över längdskalor

Summary

Hi-C 3.0 är ett förbättrat Hi-C-protokoll som kombinerar formaldehyd- och disuccinimidylglutarat-tvärbindare med en cocktail av DpnII- och DdeI-restriktionsenzymer för att öka signal-brusförhållandet och upplösningen av kromatininteraktionsdetektering.

Abstract

Kromosomkonformationsfångst (3C) används för att detektera tredimensionella kromatininteraktioner. Vanligtvis används kemisk tvärbindning med formaldehyd (FA) för att fixa kromatininteraktioner. Därefter omvandlar kromatinsmältning med ett restriktionsenzym och efterföljande religering av fragmentändar tredimensionell (3D) närhet till unika ligeringsprodukter. Slutligen, efter omkastning av tvärbindningar, proteinavlägsnande och DNA-isolering, skjuvas DNA och förbereds för sekvensering med hög genomströmning. Frekvensen av närhetsligering av par av loci är ett mått på frekvensen av deras samlokalisering i tredimensionellt utrymme i en cellpopulation.

Ett sekvenserat Hi-C-bibliotek ger genomomfattande information om interaktionsfrekvenser mellan alla par av loci. Upplösningen och precisionen hos Hi-C är beroende av effektiv tvärbindning som upprätthåller kromatinkontakter och frekvent och enhetlig fragmentering av kromatinet. Detta dokument beskriver ett förbättrat Hi-C-protokoll på plats , Hi-C 3.0, som ökar effektiviteten för tvärbindning genom att kombinera två tvärbindare (formaldehyd [FA] och disuccinimidylglutarat [DSG]), följt av finare matsmältning med två restriktionsenzymer (DpnII och DdeI). Hi-C 3.0 är ett enda protokoll för exakt kvantifiering av genomvikningsfunktioner i mindre skalor som slingor och topologiskt associerande domäner (TADs), liksom funktioner i större kärnomfattande skalor som fack.

Introduction

Kromosomkonformationsfångst har använts sedan 2002¹. I grund och botten är varje konformationsfångstvariant beroende av fixering av DNA-protein och protein-proteininteraktioner för att bevara 3D-kromatinorganisation. Detta följs av DNA-fragmentering, vanligtvis genom restriktionssmältning, och slutligen religation av närliggande DNA-ändar för att omvandla rumsligt proximala loci till unika kovalenta DNA-sekvenser. Initiala 3C-protokoll använde PCR för att prova specifika “en-till-en” -interaktioner. Efterföljande 4C-analyser möjliggjorde detektering av “en-till-alla” interaktioner², medan 5C detekterade “många-till-många” interaktioner³. Kromosomkonformationsfångst kom till full frukt efter att ha implementerat nästa generations sekvensering med hög genomströmning (NGS), vilket möjliggjorde detektion av “allt-till-alla” genomiska interaktioner med hjälp av genomomfattande^Hi-C4 och jämförbara tekniker som 3C-seq⁵, TCC⁶ och Micro-C ^7,8 (se även granskning av Denker och De Laat⁹).

I Hi-C används biotinylerade nukleotider för att markera 5 ′ överhäng efter matsmältning och före ligering (figur 1). Detta möjliggör val av korrekt smälta och religerade fragment med hjälp av streptavidinbelagda pärlor, vilket skiljer det från GCC¹⁰. En viktig uppdatering av Hi-C-protokollet implementerades av Rao et ^al.11, som utförde matsmältningen och religationen i intakta kärnor (dvs. in situ) för att minska falska ligeringsprodukter. Dessutom minskade fragmentstorleken och ökade upplösningspotentialen för Hi-rötning genom att ersätta HindIII-matsmältningen med MboI (eller DpnII). Denna ökning möjliggjorde detektion av relativt småskaliga strukturer och en mer exakt genomisk lokalisering av kontaktpunkter, såsom DNA-slingor mellan små cis-element, t.ex. slingor mellan CTCF-bundna platser genererade av loopextrudering^11,12. Denna potential kostar dock. För det första kräver en tvåfaldig ökning av upplösningen en fyrfaldig (2²) ökning av sekvenseringsläsningarna¹³. För det andra ökar de små fragmentstorlekarna möjligheten att missta osmälta angränsande fragment för smälta och religerade fragment¹⁴. Som nämnts skiljer sig i Hi-C smälta och religerade fragment från osmälta fragment genom närvaron av biotin vid ligeringskorsningen. Korrekt borttagning av biotin från oligierade ändar krävs dock för att säkerställa att endast ligeringskorsningar dras ner^14,15.

Med den minskande kostnaden för NGS blir det möjligt att studera kromosomveckning mer detaljerat. För att minska storleken på DNA-fragment och därmed öka upplösningen kan Hi-C-protokollet anpassas för att oftare använda skärande restriktionsenzymer¹⁶ eller för att använda kombinationer av restriktionsenzymer^17,18,19. Alternativt kan MNase ^7,8 i Micro-C och DNase i DNase Hi-C²⁰ titreras för att uppnå optimal matsmältning.

En nyligen genomförd systematisk utvärdering av grunderna i 3C-metoder visade att detekteringen av kromosomvikningsfunktioner på varje längdskala förbättrades avsevärt med sekventiell tvärbindning med 1% FA följt av 3 mM DSG¹⁷. Dessutom var Hi-C med HindIII-matsmältning det bästa alternativet för att upptäcka storskaliga vikningsfunktioner, såsom fack, och att Micro-C var överlägsen för att upptäcka småskaliga vikningsfunktioner som DNA-slingor. Dessa resultat ledde till utvecklingen av en enda, högupplöst “Hi-C 3.0” -strategi, som använder kombinationen av FA- och DSG-tvärbindare följt av dubbel matsmältning med DpnII- och DdeI-endonukleaser²¹. Hi-C 3.0 ger en effektiv strategi för allmän användning eftersom den exakt upptäcker vikningsfunktioner över alla längdskalor¹⁷. Den experimentella delen av Hi-C 3.0-protokollet beskrivs här och typiska resultat som kan förväntas efter sekvensering visas.

Bild 1: Hi-C-procedur i sex steg. Celler fixeras först med FA och sedan DSG (1). Därefter föregår lys en dubbel matsmältning med DdeI och DpnII (2). Biotin tillsätts genom överhängsfyllning och proximala trubbiga ändar ligeras (3) före DNA-rening (4). Biotin avlägsnas från oligata ändar före ultraljudsbehandling och storleksval (5). Slutligen möjliggör neddragning av biotin adapterligering och biblioteksförstärkning med PCR (6). Förkortningar: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; B = Biotin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Fixering genom tvärbindning Formaldehydfixering: från celler i monolagerLåt cellerna vara sådda i lämpligt medium för att skörda 5 × 106 celler per 150 mm platta.OBS: Användare kan välja vilken behållare som helst som säkerställer optimal tillväxt av alla däggdjurscellinjer. Dessutom kan celler isoleras från vävnad. Aspirera mediet med en Pasteur-pipett kopplad till en vakuumfälla från 150 mm platta, tvätta 2x med ~ 10 ml HBSS. Omedelbart före tvärbindning, förbered en 1% FA-tvärbindningslösning i ett 50 ml rör genom att kombinera 22,5 ml HBSS och 625 μL 37% FA till en slutlig 1% koncentration. Blanda försiktigt genom att gunga.VARNING: Använd dragskåp; Formaldehyd är giftigt. För att tvärbinda cellerna, häll 23.125 ml av 1% FA-lösningen till varje 15 cm platta. Inkubera vid rumstemperatur i 10 min och gunga försiktigt plattorna för hand var 2: e minut. Tillsätt 1,25 ml 2,5 M glycin (128 mM final) och virvla försiktigt plattan för att släcka tvärbindningsreaktionen. Inkubera vid rumstemperatur i 5 min och fortsätt inkubationen på is i minst 15 min för att stoppa tvärbindningen. Skrapa cellerna från plattorna med en cellskrapa eller gummipolis. Överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör med en pipett. Centrifugera vid 1 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten genom aspiration. Tvätta cellpelleten en gång med 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med en pipett till återupplivning. Centrifugera sedan vid 1 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Fortsätt omedelbart till DSG-tvärbindning.OBS: Var försiktig när du tvättar cellpelleten eftersom cellpellets kan vara lösa och celler kan gå förlorade. Formaldehydfixering: från celler i suspensionLåt cellerna vara sådda i lämpligt medium för att skörda 5 × 106 celler per kärl.OBS: Användare kan välja vilken behållare som helst som säkerställer optimal celltillväxt för alla däggdjurscellinjer. Omedelbart före skörden, räkna cellerna och överför 5 × 106 celler till ett 50 ml koniskt rör. Pellera försiktigt cellerna genom centrifugering vid 300 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Förbered 1% FA-tvärbindningslösning genom att tillsätta 1,25 ml 37% FA till 45 ml HBSS och blanda genom att invertera röret flera gånger.OBS: Lägg till hela 1.25 ml FA utan att dela upp beloppet.VARNING: Formaldehyd är mycket giftigt. Återsuspendera cellpelleten i 46,25 ml 1% FA-tvärbindningslösning som framställts i föregående steg genom pipettering upp och ner. Inkubera vid rumstemperatur i exakt 10 min på rotator, vippa eller genom skonsam manuell inversion av röret var 1-2:e minut. Släck tvärbindningsreaktionen genom att tillsätta 2,5 ml 2,5 M glycin (128 mM final) och blanda väl genom att invertera röret. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och sedan på is i minst 15 min för att stoppa tvärbindningen helt. Centrifugera vid rumstemperatur för att pelletera de tvärbundna cellerna vid 1 000 × g i 10 minuter och kassera supernatanten genom aspiration. Tvätta cellerna en gång med 10 ml DPBS och centrifugera sedan vid 1 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten helt med en pipett och fortsätt omedelbart till DSG-tvärbindning.OBS: Var försiktig när du tvättar cellpelleten eftersom cellpellets kan vara lösa och celler kan gå förlorade. Tvärbindning med disuccinimidylglutaratÅtersuspendera de pelleterade cellerna i 9,9 ml DPBS innan du tillsätter 100 μl 300 mM DSG (3 mM final). Blanda efter inversion.OBS: DSG är fuktkänsligt. Det är viktigt att förbereda ett nytt lager av 300 mM DSG i DMSO på dagen för tvärbindning.VARNING: DSG i DMSO är mycket giftigt. Tvärbinda cellerna i rumstemperatur i 40 minuter på en rotator. Tillsätt 1,925 ml 2,5 M glycin (400 mM final), invertera för att blanda och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter. Centrifugera cellerna vid 2 000 × g i 15 minuter vid rumstemperatur.OBS: Var försiktig när du tar bort supernatanten från lösa cellpellets. Återsuspendera pelleten i 1 ml 0,05% bovint serumalbumin (BSA) -DPBS och överför till ett 1,7 ml rör.OBS: Tillsatsen av BSA kan bidra till att minska cellklumpning. Centrifugera cellerna vid 2 000 × g i 15 minuter vid 4 °C och avlägsna supernatanten med pipett.OBS: För att undvika att förlora pelleten, ta snabbt och helt bort supernatanten. Snäppfrys pelleten i flytande kväve och förvara vid -80 °C eller fortsätt omedelbart till nästa steg. 2. Fångst av kromosomkonformation Celllys och kromatinsmältningÅtersuspendera (pipet) de tvärbundna cellalikvoterna (~ 5 × 106 celler) i 1 ml iskall lysbuffert (recept i kompletterande tabell S1) innehållande 10 μL proteashämmare cocktail och överför till en dounce homogenisator för en 15 min inkubation på is.OBS: Tillsätt proteashämmare till lysbufferten omedelbart före användning. Rör långsamt stöt A upp och ner 30 gånger för att homogenisera cellerna på is och inkubera på is i 1 min så att cellerna kan svalna, innan ytterligare 30 slag. Överför lysatet till ett 1,7 ml mikrocentrifugrör.OBS: Håll upphängningen i rörelse eftersom celler ibland fastnar i pipettspetsen. Centrifugera den lyserade suspensionen vid 2 500 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Kasta supernatanten och snärta eller virvla den våta pelleten till återupplivning. Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt för att få ett yoghurtliknande ämne med minimala klumpar. Återsuspendera pelleten i 500 μl iskall 1x restriktionsbuffert (från 10x; se recept i tilläggstabell S1) och centrifugera i 5 min vid 2 500 × g. Upprepa detta steg för en andra tvätt.OBS: Pelleten i 1x begränsningsbuffert är mer granulär än den tidigare pelleten i lysbufferten. Återsuspendera cellerna i en slutlig volym på 360 μL 1x begränsningsbuffert genom pipettering efter tillsats av ~ 340 μL till pelletsens överföringsvolym, vilket beror på cellstorleken. Avsätt 18 μl av varje lysat för testning av kromatintegriteten (CI). Förvara CI-proverna vid 4 °C. Tillsätt 38 μl 1% natriumdodecylsulfat (SDS) till varje Hi-C-rör (total volym på 380 μl) och blanda försiktigt genom pipettering utan att införa bubblor.VARNING: SDS är giftigt. Inkubera proverna vid 65 °C utan att skaka i exakt 10 minuter för att öppna kromatinet. Lägg omedelbart rören på is och förbered digestionsblandningen med Triton X-100 för att släcka SDS enligt beskrivningen i tabell 1. Tillsätt 107 μL av rötningsblandningen till Hi-C-röret (totalt 487 μl) för att smälta kromatinet över natten (~16 timmar) vid 37 °C i en termomixer med intervallskakning (t.ex. 900 rpm, 30 s på, 4 min av).OBS: Tillsatsen av Triton till en slutlig koncentration på 1% tjänar till att släcka SDS. Biotinylering av DNA-ändarEfter uppslutningen över natten överför du proverna till 65 °C i 20 minuter för att inaktivera den återstående endonukleasaktiviteten. Under inkubationen, förbered en fill-in master mix som visas i tabell 2. Efter inkubation, placera proverna omedelbart på is. Avsätt en 10 μl rötningskontroll (DC) för varje prov och förvara vid 4 °C. Ta bort kondensen från locket med en pipett eller genom att snurra. Tillsätt 58 μl biotinfyllningsblandning (total provvolym 535 μl) och pipett försiktigt till varje prov utan att bilda bubblor. Inkubera proverna vid 23 °C i 4 timmar i en termomixer (t.ex. 900 rpm, 30 s på, 4 min av). Ligering av proximala DNA-fragmentFörbered ligeringsblandningen enligt tabell 3 medan biotinfyllningen ruvar. Tillsätt 665 μl av ligeringsblandningen till varje prov (total provvolym 1,200 μl). Blanda försiktigt genom pipettering. Inkubera proverna vid 16 °C i 4 timmar i en termomixer med intervallskakning (t.ex. 900 rpm, 30 s på, 4 min av). Förvara dessa prover som innehåller kovalent bundet kromatin vid 4 °C i några dagar. Omvänd tvärbindningBringa volymerna för CI- och DC-proverna till 50 μL med 1x Tris Low EDTA (TLE; se receptet i tilläggstabell S1). Tillsätt 10 μl 10 mg/ml proteinas K till CI- och DC-prover. Inkubera vid 65 °C över natten med intervallskakning (t.ex. 900 rpm, 30 s på, 4 min av). Alternativt kan du utföra en 30 minuters omvändning av tvärbindningen för dessa kontroller under DNA-rening av Hi-C-proverna. Tillsätt 50 μl 10 mg/ml proteinas K till varje Hi-C-prov och inkubera vid 65 °C i minst 2 timmar med intervallskakning (t.ex. 900 rpm, 30 s på, 4 min av). Tillsätt ytterligare 50 μl 10 mg/ml proteinas K till varje Hi-C-rör (total provvolym 1 300 μl) och fortsätt inkubera vid 65 °C över natten. Förvaras vid 4 °C tills DNA-rening.OBS: Att dela upp proteinas K-inkubationer säkerställer total proteinsmältning. DNA-reningLåt rören svalna från 65 °C ner till rumstemperatur. Överför varje prov till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt en 2,6 ml (2x volym) fenol: kloroform: isoamylalkohol till varje rör.VARNING: Fenol:kloroform:isoamylalkohol är ett mycket giftigt irriterande ämne och är potentiellt cancerframkallande. Vörda varje rör i 1 min och överför sedan innehållet till ett 15 ml faslåsrör. Centrifugera proverna i 5 minuter med maximal hastighet (1 500–3 500 × g) i en bänkcentrifug. Häll försiktigt vattenfasen i ett 35 ml ultracentrifugrör och tillsätt ultrarent vatten till en slutlig volym på 1 250 μl.OBS: Använd rör för att passa den tillgängliga ultracentrifugen eller dela upp i flera mikrocentrifugrör. Tillsätt en volym på 1/10( ~ 125 μl) av 3 M natriumacetat och blanda väl genom inversion. Tillsätt en 2,5x volym (~ 3,4 ml) iskall 100% etanol till varje prov, balansera rören för ultracentrifugering genom att tillsätta iskall 100% etanol och blanda väl genom inversion. Inkubera rören på torris i ~15 min (undvik stelning). Centrifugera rören vid 18 000 × g i 30 minuter vid 4 °C.OBS: För vinklade rotorer: markera rören för var pelleten kommer att vara. Använd en pipett, ta bort och kassera supernatanten helt från icke-pelletssidan.OBS: Vid denna tidpunkt bör pelleten bli synlig och kan markeras på röret, eftersom det kanske inte är tydligt synligt efter torkning i nästa steg. Lufttorka proverna i cirka 10 minuter eller tills de är synligt torra. Lösgör varje pellet i 450 μl 1x TLE genom pipettering eller virvling och överför till 0,5 ml centrifugalfilterenhet (CFU) med en 3 kDa molekylviktsavgränsning. Centrifugera CFU:n på högsta hastighet i 10 min och kassera genomströmningen. Tvätta varje ultracentrifugrör med ytterligare 450 μL 1x TLE och överför till dess CFU för ytterligare en tvätt.OBS: Att tvätta CFU på detta sätt begränsar DNA-förlusten samtidigt som saltkoncentrationen minskar. Centrifugera CFU:n på högsta hastighet i 10 min och kassera genomströmningen. Tillsätt 80 μL 1x TLE till kolonnen och vänd kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör innan du centrifugerar i 2 minuter med maximal hastighet för att få en slutlig volym på ~ 100 μl. Tillsätt 1 μl RnaseA (1 mg/ml; 10 gånger spädning av 10 mg/ml stam) till varje prov och inkubera vid 37 °C på ett värmeblock, i ett vattenbad eller en termomixer i minst 30 minuter. Efter Rnase-behandlingen, ta bort proverna från 37 °C och förvara vid 4 °C tills kvalitetskontrollsteget. Kontroll av kromatinkvalitet, enzymsmältning och provligeringKyl CI- och likströmsproverna till rumstemperatur efter att tvärbindningarna har vänts i steg 2.4.5. Överför sedan till ett förspunnet 2 ml faslåsrör.OBS: Se till att faslåsinnehållet är centrifugerat till en pellets (maxhastighet i 2 min). Tillsätt 200 μl fenol:kloroform:isoamylalkohol och blanda proverna genom virvel i 1 min. Centrifugera rören i 5 min med maximal hastighet. Överför vattenfasen från varje prov (~ 50 μL) till ett nytt 1,7 ml mikrofugerör. Tillsätt 1 μl Rna A (från 1 mg/ml) och inkubera vid 37 °C i minst 30 minuter. Fyll proverna på en 0,8% agarosgel enligt rekommendationerna i tabell 4.OBS: De förväntade resultaten från en kvalitetskontroll visas i figur 2. Kvantifiera DNA genom densitometri från gelén eller med Qubit eller Nanodrop.OBS: Noggrann kvantifiering säkerställer rätt ingångsvolym i nästa del av protokollet. Använd flera standarder med en känd kvantitet för att konstruera en standardkurva. Tabell 1: Reagens för matsmältning. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 2: Biotinfyllningsreagenser. *Observera att byte av enzymer kan kräva olika buffertar och biotinylerade dNTP. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 3: Reagenser för ligeringsblandning. Förkortning: BSA = bovint serumalbumin. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 4: Parametrar för gelbelastning för bedömning av kvalitet och storleksval. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Figur 2: Agarosgel som visar typiska resultat från kvalitetskontroll av postDNA-rening . (A) CI-kontrollen bör indikera ett band med DNA med hög molekylvikt. (B) DC- och Hi-C-proverna visar en rad DNA-storlekar. Hi-C-provet, som har kombinerats till större fragment, bör ha högre molekylvikt än DC. Koncentrationsområdet för markörer gör det möjligt att generera en standardkurva. Observera att i det här exemplet laddades CI på en separat gel, men det rekommenderas att ladda och köra alla prover och kontroller tillsammans. Förkortningar: CI = kromatinintegritet; DC = kontroll av matsmältningen; Hi-C = närhets-ligerad. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 3. Hi-C sekvensering av biblioteksförberedelse Avlägsnande av biotin från olikaterade ändarFörbered biotinborttagningsreaktioner enligt tabell 5.OBS: Vanligtvis är 10 μg DNA tillräckligt, men upp till 30 μg kan användas. Fördela 2 x 65 μL alikvoter från varje 130 μl reaktion i två PCR-rör. Överför till en termocykler eller PCR-maskin och inkubera enligt beskrivningen i tabell 5.OBS: Prover kan lagras här vid 4 ° C (dagar till veckor), -20 ° C (lång sikt), eller omedelbart överföras till ultraljudsbehandling. UltraljudsbehandlingSlå samman provdubbletter från biotin avlägsnande steg (130 μL total provvolym) till en 130 μL sonicator rör för ultraljudsbehandling. Sonicate proverna med hjälp av parametrarna i tabell 6 för att uppnå en snäv smal fördelning under 500 bp.OBS: Olika sonicator typer kan användas, men för en smal fragment distribution (100-500 bp), sonicator inställningar kan kräva optimering. Storleksval med magnetiska pärlorPipet det sonikerade DNA från sonicator röret (s) till en 1.7 ml låg bindande rör. Ta varje prov till en total volym på 500 μl med 1x TLE. Försök att få volymen så nära 500 μL som möjligt, eftersom förhållandet mellan prov och magnetisk pärlblandning är avgörande för storleksval. Tillsätt 400 μl magnetisk pärlblandning till varje rör för att uppnå ett förhållande mellan magnetisk pärlblandning och provvolymen 0,8.OBS: Under dessa förhållanden fångar pärlor DNA-fragment > 300 bp, vilket kommer att vara den övre fraktionen. Supernatanten kommer att innehålla fragment <300 bp, vilket kommer att vara den lägre fraktionen. Blanda rören genom virvel och inkubera i 10 min vid rumstemperatur på en rotator. För detta och andra storleksvalsförhållanden, se till att provets fulla volym blandas väl. Leta efter det “oregelbundna läget” som vissa rotorer har, vilket fungerar bra för mindre volymer. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur på en magnetisk partikelavskiljare (MPS). Under inkuberingen, tillsätt 500 μl av magnetiska pärlor blandningen till ett nytt 1,7 μL lågbindande rör för varje prov.OBS: Dessa rör kommer att användas för nästa storleksval av den nedre fraktionen genom att generera ett magnetiskt pärlblandning till provförhållande på 1,1: 1. Låt rören stå på MPS i 5 minuter. Ta bort supernatanten från pärlorna och återsuspendera med 150 μL av magnetpärlblandningen.OBS: Detta steg undviker mättnad av pärlorna med DNA genom att öka antalet pärlor utan att öka volymen. Överför supernatanten från steg 3.3.5 till det märkta röret som är förberett för att välja den nedre fraktionen (steg 3.3.8).OBS: 150 μL magnetisk pärlblandning + 400 μL 0,8x magnetisk pärlblandning (550 μL totalt) dividerat med 500 μL av det ursprungliga provet = 1,1x magnetisk pärlblandning till provförhållande. Blanda de nedre fraktionsrören genom att virvla och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur på en rotator.OBS: Pärlorna binder DNA-fragment >100 bp, vilket resulterar i en slutlig pärlbunden fraktion av 100-300 bp. Sätt de nedre fraktionsrören på MPS i 5 minuter (rumstemperatur). Ta bort supernatanten och centrifugera rören en kort stund för att ytterligare ta bort supernatanten så mycket som möjligt. Tvätta pärlorna från båda fraktionerna två gånger med 200 μl 70% etanol och återvinn pärlorna i 5 minuter på MPS varje gång. Efter en snabb snurrning i en centrifug, ta bort etanolen helt och torka pärlorna ytterligare på MPS.OBS: Torka tills alkoholen är helt indunstad. Pelleten ska se ut som mörk choklad utan sprickbildning (kan ta ~10 min). Återsuspendera båda fraktionerna i 50 μl 1x TLE-buffert. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter och tryck eller snärta rören varannan minut för att stimulera blandning och eluering. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 5 minuter för båda fraktionerna. Håll supernatanten från varje prov. Pipa supernatanten i ett 1,7 ml lågt bindningsrör.OBS: Proverna kan förvaras vid 4 °C i några dagar eller vid -20 °C under lång tid. Kör en 2% agarosgel som i tabell 4 för att bestämma provets kvalitet och kvantitet. Se figur 3 för ett exempel på en sådan gel.OBS: Om från erfarenhet, ultraljudsbehandling är mycket reproducerbar, kan man hoppa över denna gel och fortsätta att avsluta reparationen omedelbart. Det rekommenderas att användare håller fast vid de övre fraktionerna tills efter titrering PCR. Suboptimala DNA-mängder som skulle kräva mycket PCR-förstärkning kan räddas från material i den övre fraktionen. Kvantifiera mängden DNA från gelén direkt efter att ha genererat en standardkurva från den kända DNA-stegens ingång eller med hjälp av en Qubit eller Nanodrop. Avsluta reparationBered slutreparationsblandningen enligt tabell 7 (mängd per reaktion angiven). Överför de återstående 46 μl eluerat DNA från den nedre fraktionen till PCR-rör och tillsätt 24 μl av den beredda ändreparationsblandningen. Inkubera i en PCR-maskin, enligt förslaget i tabell 7. När programmet är klart, håll proverna vid 4 ° C tills de dras ner. Neddragning av biotinylerade ligeringsprodukter med streptavidinbelagda pärlorBestäm mängden streptavidinbelagda pärlor för varje bibliotek utifrån det kvantifierade storleksvalet (steg 3.3.19).OBS: Dessa streptavidinbelagda pärlor (10 mg / ml lösning) kan binda 20 μg dubbelsträngat DNA per mg pärlor (= 20 μg / 100 μL pärlor). Använd 2 μl för varje 1 μg Hi-C-DNA men inte mindre än 10 μl. Blanda de streptavidinbelagda pärlorna och pipetten den volym pärlor som behövs för varje bibliotek (beräknat i föregående steg) i enskilda 1,7 ml lågbindande rör. Återsuspendera pärlorna i 400 μl interpoleringsbuffert (TWB; se recept i tilläggstabell S1) och inkubera i ~3 minuter vid rumstemperatur på en rotator (se instruktionerna i steg 3.3.4). Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och ta bort supernatanten. Tvätta pärlorna genom att pipettera ytterligare 400 μl TWB. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 400 μl 2x bindningsbuffert (BB) (recept i kompletterande tabell S1) till pärlorna och återupplivningen. Tillsätt dessutom 330 μL 1x TLE och lösningen från End-repair (från steg 3.4.3). Inkubera proverna i 15 minuter vid rumstemperatur medan de blandas på en rotator. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 400 μl 1x BB till pärlorna och återupplivningen. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och ta bort supernatanten. Tillsätt 100 μl 1x TLE för att tvätta pärlorna. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och ta bort supernatanten. Slutligen tillsätt 41 μL 1x TLE för att återsuspendera pärlorna. A-tailingFörbered A-tailingblandningen enligt tabell 8. Pipettera reaktionerna i PCR-rör och inkubera enligt tabell 8. Placera PCR-rören på is omedelbart efter avlägsnande från termocykler och överför innehållet till 1,7 ml lågbindande rör. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och kassera supernatanten. Tillsätt 400 μL 1x ligeringsbuffert, utspädd från 5x T4 DNA-ligasbuffert med ultrarent vatten. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och kassera sedan supernatanten. Tillsätt 1x ligeringsbuffert till en slutlig volym på 40 μl. Glödgningsadapter oligosBered adapteroligolager på 100 μM (tabell 9).OBS: Beställ 250 nmol HPLC-renade oligos. Glödga adaptrarna i PCR-rör enligt beskrivningen i tabell 9. Använd en PCR-termocykler för att gradvis höja temperaturen vid 0,5 °C/s till 97,5 °C. Håll vid 97,5 °C i 2,5 min. Använd en PCR-termocykler för att gradvis höja temperaturen vid 0,1 °C/s i 775 cykler (upp till 20 °C). Håll temperaturen vid 4 °C tills den används vidare. Tillsätt 83 μl 1x glödgningsbuffert (recept i tilläggstabell S1) för att späda ut adaptrarna till 15 μM. Förvara adaptrarna vid -20 °C. Sekvensering av adapterligeringFörbered adapterns ligeringsblandning i ett 1,7 ml lågbindande rör (tabell 10). Ligate i 2 timmar vid rumstemperatur. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 1 min och kassera supernatanten. Tillsätt 400 μl TWB och pipa pärlorna försiktigt upp och ner före inkubation på rotatorn i 5 minuter vid rumstemperatur. Separera pärlorna från supernatanten på MPS och upprepa detta steg en gång till. Separera pärlorna från supernatanten på MPS (~ 1 min), kassera supernatanten och tillsätt 200 μL 1x BB. Separera pärlorna från supernatanten på MPS (~ 1 min) och kassera supernatanten. Tillsätt 200 μL 1x pre-PCR-buffert (från 10x; recept i tilläggstabell S1) och överför till ett nytt 1,7 ml lågbindande rör. Separera pärlorna från supernatanten på MPS (~ 1 min) och kassera supernatanten. Tillsätt 20 μl 1x pre-PCR-buffert och blanda genom pipettering. Förvara rören på is när de används eller förvaras vid 4 °C. Optimering av PCR-cykelnumret genom titreringStäll in 30 μl huvudblandningsreaktioner per prov enligt tabell 11 (mängd per given reaktion). Kör det lägsta antalet cykler och ta en alikvot på 5 μl. Kör ytterligare 2-3 cykler på den återstående reaktionen innan du tar nästa 5 μL alikvot. Upprepa för att samla fyra alikvoter. Använd PCR-parametrar från tabell 11 för varje alikvot. Tillsätt 5 μl vatten och 2 μl 6x färgämne till varje 5 μl prov. Kör på en 2% agaros TBE gel (recept i kompletterande tabell S1) med 25-150 ng lågmolekylär viktstege. Se figur 4 för förväntade resultat.OBS: Ett optimalt antal cykler för det slutliga bibliotekets PCR-förstärkning [steg 3.10] är det lägsta antalet cykler för att få synlig produkt på gelén minus en cykel. Slutlig PCR-förstärkning av biblioteketStäll in 12 x 30 μl-reaktioner för att förstärka varje slutligt bibliotek för sekvensering som i tabell 11. Cykla PCR-reaktionerna enligt tabell 11 efter bestämning av antalet cykler efter PCR-titrering (steg 3.9.3). När PCR är klar, slå samman replikatproverna i ett 1,7 ml lågbindande mikrofugerör. Placera rören på MPS och överför supernatanten till ett nytt 1,7 ml lågbindande mikrofugerör. Återsuspendera de kvarvarande streptavidinbelagda pärlorna i 20 μL 1x pre-PCR-buffert.OBS: Denna mall kan återanvändas när den förvaras vid 4 °C i dagar till veckor eller på lång sikt vid -20 °C. Ta bort primers med magnetisk pärlblandningAnvänd 1x TLE-buffert (recept i tilläggstabell S1) för att justera volymen från steg 3.10.4 till exakt 360 μL. Tillsätt 360 μl av magnetpärlornas blandning till varje prov och pipettera upp och ner för att blanda. Blanda proverna i 10 minuter vid rumstemperatur på en rotator. Separera pärlorna från supernatanten på MPS vid rumstemperatur (3-5 min). Tvätta pärlorna två gånger med 200 μl 70% etanol och återvinn pärlorna i 5 minuter på MPS varje gång. Snabbspinn i en centrifug och pipettera helt av etanolen. Torka pärlorna i luft på MPS för att ytterligare avdunsta etanolen.OBS: Pelleten ska se ut som mörk choklad utan sprickbildning (kan ta ~ 10 min). Tillsätt 30 μl ultrarent vatten och återsuspendera för att eluera DNA i 10 minuter vid rumstemperatur. Snärta rören var 2: e minut för att hjälpa till att blanda. Separera pärlorna från supernatanten på MPS i 5 minuter. Samla supernatanten från varje prov i ett nytt 1,7 ml rör. Kör 1 μL av biblioteket på en 2% agaros TBE (recept i kompletterande tabell S1) gel för att få en fragmentstorleksfördelning och för att kvantifiera det slutliga biblioteket (figur 5).OBS: ClaI-matsmältning kan endast ske för DpnII-DpnII-korsningar och fungerar som en positiv ligeringskontroll som bör resultera i en lägre fragmentstorleksfördelning för det slutliga biblioteket. Slutliga bibliotek kan lagras i några dagar vid 4 °C, på lång sikt vid -20 °C eller omedelbart spädas ut och skickas in för sekvensering. Tabell 5: Reagenser och temperaturer för borttagning av biotin Klicka här för att ladda ner denna tabell. Tabell 6: Parametrar för ultraljudsbehandling. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 7: Slutreparationsreagens och temperaturer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 8: A-tailing reagens och temperaturer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 9: PCR-primers och Paired-End-adapter oligos med reagens glödgning för glödgning. Förkortning: 5PHOS = 5′ fosfat. Asterisker indikerar fosforotioerade DNA-baser. # Kombinera en indexerad oligo med Universal oligo för att glödga till ett indexerat kort. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 10: Reagens för adapterligering. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Tabell 11: PCR-reagenser och cykelparametrar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen. Figur 3: Agarosgel som visar typiska urvalsresultat efter storlek. De övre och nedre fraktionerna för fyra prover (numrerade 1-4) av DpnII-DdeI Hi-C visas. Den första körfältet för varje prov innehåller den övre fraktionen, härledd från en 0,8x magnetisk pärlblandning, och den andra och tredje körfältet innehåller en utspädning av den nedre fraktionen härledd från en 1,1x magnetisk pärlblandning. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Agarosgel med PCR-titreringsresultat. Från och med 5 cykler av PCR tas prover efter var 2: e cykel (5, 7, 9 och 11 cykler) för vart och ett av fyra bibliotek. Baserat på denna figur valdes 6 cykler som den optimala cykeln för varje prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Slutliga PCR-produkter. Efter rengöring och storleksval laddades PCR-produkter (Hi-C) bredvid en ClaI-smält fraktion av samma bibliotek (ClaI). ClaI-smälta fragment indikerar närvaron av eftertraktade DpnII-DpnII-ligeringar. Observera att ClaI inte smälter DpnII-DdeI-korsningar och därför kommer inte alla ligeringar att bidra till en storleksminskning från denna begränsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Figurerna i detta manuskript genererades från ett separat, replikerat experiment av det som tidigare publicerats av Lafontaine et al.21. Efter att ha erhållit sekvenseringsdata med hög genomströmning användes Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) för att bearbeta Hi-C-data. En liknande pipeline finns på dataportalen för 4D Nucleome-projektet (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Kortfattat implementerades Nextflow-pipelinedestilleriet (https://github.com/open2c/distiller-nf) för att (1) anpassa sekvenserna av Hi-C-molekyler till referensgenomet, (2) analysera .sam-justering och bilda filer med Hi-C-par, (3) filtrera PCR-dubbletter och (4) aggregera par i binned matriser av Hi-C-interaktioner. Dessa HDF5-formaterade matriser, kallade kylare, kan sedan (1) ses på en HiGlass-server (https://higlass.io/) och (2) analyseras med hjälp av en stor uppsättning beräkningsverktyg med öppen källkod som finns i samlingen “cooltools” som underhålls av Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) för att extrahera och kvantifiera vikningsfunktioner som fack, TADs och loopar. Vissa kvalitetsindikatorer för Hi-C3.0-biblioteken kan bedömas omedelbart efter kartläggning av läspar till ett referensgenom, med hjälp av några enkla mätvärden/indikatorer. För det första kan vanligtvis ~ 50% av sekvenserade läspar kartläggas unikt för mänskliga celler. På grund av kromosomernas polymera natur representerar de flesta av dessa kartlagda läsningar (~ 60% -90%) interaktioner inom en kromosom (cis), med interaktionsfrekvenser som snabbt sönderfaller med ökande genomiskt avstånd (avståndsberoende sönderfall). Det avståndsberoende sönderfallet kan visualiseras bäst i ett “skalningsdiagram”, som visar kontaktsannolikheten (per kromosomarm) som en funktion av genomiskt avstånd. Vi fann att användningen av olika tvärbindare och enzymer kan förändra det avståndsberoende sönderfallet på lång- och kortdistansavstånd17. Tillsatsen av DSG-tvärbindning ökar detekterbarheten av interaktioner på korta avstånd i kombination med enzymer som Mnase och kombinationer av DpnII-DdeI som producerar mindre fragment (figur 6A). Avståndsberoende sönderfall kan också observeras direkt från 2D-interaktionsmatriser: interaktioner blir mer sällsynta när de ligger längre bort från den centrala diagonalen (figur 6B). Dessutom kan genomiska vikningsfunktioner, såsom fack, TADs och loopar identifieras från Hi-C-matriser och skalningsdiagram som avvikelser från det allmänna genomomfattande genomsnittliga avståndsberoende sönderfallet. Viktigt är att tvärbindning med DSG utöver FA minskar slumpmässiga ligeringar, som är obegränsade på grund av kromosomernas polymera natur och därför mer sannolikt att uppstå mellan kromosomer (i trans) (Figur 6C). Att minska slumpmässig ligering leder till ökade signal-brusförhållanden, särskilt för interkromosomala och mycket långa (>10-50 Mb) intrakromosomala interaktioner. Bild 6: Representativa resultat av mappade och filtrerade Hi-C-bibliotek. (A) Skalningsdiagram med kontaktsannolikhet och dess derivata för olika enzymer, ordnade efter fragmentlängd (överst) och tvärbindning med antingen FA eller FA + DSG (botten). Matsmältning med MNAse (microC) eller DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) ökar signifikant kortdistanskontakter (överst) liksom att lägga till DSG till FA (botten). (B) Kolumner visar Hi-C-värmekartor över DpnII-matsmältningen efter bara FA-tvärbindning och DpnII- eller DdeI-uppslutning efter FA + DSG-tvärbindning. Vita pilar visar ökande styrka av “prickar” efter DSG-tvärbindning och DdeI-matsmältning, vilket innebär bättre detektion av DNA-slingor. Rader visar olika delar av kromosom 3 vid ökande upplösning, i linje med panel C: översta raden: hela kromosom 3 (0-198,295,559 Mb); mellersta raden: 186-196 Mb; nedre raden: 191,0-191,5 Mb. (C) Täckningsdiagram för de regioner som visas i A. Svarta pilar visar den lägre täckningen (% cis-läsningar) för endast FA-tvärbindning. Förkortningar: FA = formaldehyd; DSG = disuccinimidylglutarat; chr = kromosom. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Alla mappade läsningar är inte användbara. En andra kvalitetsindikator är antalet PCR-dubbletter. Exakta dubbletter läsningar är mycket osannolikt att inträffa av en slump efter ligering och ultraljudsbehandling. Således berodde sådana läsningar sannolikt på PCR-förstärkning och måste filtreras bort. Dubbletter uppstår ofta när för många PCR-cykler krävs för att förstärka bibliotek med låg komplexitet. I allmänhet, för Hi-C, behöver de flesta bibliotek bara 5-8 cykler av slutlig PCR-förstärkning, som bestäms av titrering PCR (se steg 3.9; Figur 4). Bibliotek med tillräcklig komplexitet kan emellertid erhållas även efter 14 cykler av PCR-förstärkning. En annan kategori av dubblettläsningar, så kallade optiska dubbletter, kan uppstå från förstärkningsprocessen på Illumina-sekvenseringsplattformar som använder mönstrade flödesceller (som HiSeq4000). Optiska dubbletter hittas från antingen överbelastning av flödescellen, vilket gör att (stora) kluster kallas två separata kluster, eller från lokal omgruppering av den ursprungliga parade ändmolekylen efter en första omgång PCR. Eftersom båda typerna av optiska dubbletter är lokala kan de identifieras och särskiljas från PCR-dubbletter genom sin plats i flödescellen. Medan bibliotek med >15% PCR-dubbletter skulle behöva regenerering, kan bibliotek med optiska dubbletter laddas om efter optimering av laddningsprocessen. Kompletterande tabell S1: Buffertar och lösningar. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Kritiska steg för cellhantering
Även om det är möjligt att använda ett lägre antal ingångsceller har detta protokoll optimerats för ~ 5 × 10⁶ celler per sekvenseringsfält (~ 400 M läsningar) för att säkerställa korrekt komplexitet efter djup sekvensering. Celler räknas bäst före fixering. För generering av ultradeep-bibliotek multiplicerar vi i allmänhet antalet banor (och celler) tills önskat läsdjup har uppnåtts. För optimal fixering bör seruminnehållande medium ersättas med PBS före FA-fixering, och fixeringslösningar bör tillsättas omedelbart och utan koncentrationsgradienter^15,22. För cellskörd föredras skrapning framför trypsinisering, eftersom övergången från en plattare till en sfärisk form efter trypsinisering kan påverka kärnkonformationen. Efter tillsats av DSG förloras lätt lösa och klumpiga cellpellets. Var försiktig när du hanterar celler i detta skede och lägg till upp till 0.05% BSA för att minska klumpningen.

Ändringar av metoden
Detta protokoll utvecklades med hjälp av mänskliga celler¹⁷. Ändå, baserat på erfarenhet av kromosomkonformationsfångst, bör detta protokoll fungera för de flesta eukaryota celler. För en betydligt lägre ingång (~ 1 × 10⁶ celler) rekommenderar vi att du använder hälften av volymerna för lys- och konformationsupptagningsprocedurerna [steg 2.1-2.4]. Detta skulle också göra det möjligt att utföra DNA-isolering [steg 2.5] i en bordscentrifug med 1,7 ml rör, vilket kan förbättra pelleteringen för låga DNA-koncentrationer. Kvantifieringen av DNA (steg 2.6.6) kommer att indikera hur man ska gå vidare. För låga mängder isolerat DNA (1-5 μg) föreslår vi att du hoppar över storleksvalet (steg 3.3) och fortsätter med biotinborttagning efter att ha minskat volymen från 130 μL till ~ 45 μL med en CFU.

Detta protokoll utvecklades specifikt för att säkerställa högkvalitativa data efter efterföljande tvärbindning med FA och DSG och matsmältning med DpnII och DdeI. Alternativa tvärbindningsstrategier som FA följt av EGS (etylenglykolbis(succinimidylsuccinat)), som också används i ChIP-seq²³ och ChIA-PET²⁴, kan dock fungera lika bra¹⁷. På liknande sätt kan olika enzymkombinationer, såsom DpnII och HinfI¹⁸ eller MboI, MseI och NlaIII¹⁹ användas för matsmältning. När du anpassar enzymkombinationer, var noga med att använda biotinylerade nukleotider som kan fylla i de specifika 5′-överhängen och använda de mest optimala buffertarna för varje cocktail. DpnII levereras med sin egen buffert och enzymtillverkaren rekommenderar en specifik buffert för DdeI-matsmältning. Men för dubbel matsmältning med DpnII och DdeI i detta protokoll rekommenderas begränsningsbuffert eftersom den är klassad till 100% aktivitet för båda enzymerna.

Felsöka konformationsavskiljning
De tre viktigaste stegen i kromosomkonformationsfångst: tvärbindning, matsmältning och relikatering har alla utförts innan resultaten kan visualiseras på gel. För att bestämma kvaliteten på vart och ett av dessa tre steg och urskilja var problem kan ha uppstått tas alikvoter före (CI) och efter matsmältningen (DC) och laddas på gelén tillsammans med det ligerade Hi-C-provet (figur 2). Denna gel används för att bestämma kvaliteten på Hi-C-provet och om det kommer att vara värt att fortsätta protokollet. Utan CI och DC är det svårt att hitta potentiella suboptimala steg. Det är värt att notera att suboptimal ligering kan bero på ett problem i själva ligeringen, fyllningen eller ett problem med tvärbindning. För att felsöka tvärbindning, se till att inte använda mer än 1 × 10⁷ celler per bibliotek och börja med färska tvärbindningsreagenser och rena celler (dvs. sköljda med PBS). För ligering, se till att celler och ligeringsblandning hålls på is. Tillsätt T4 DNA-ligas strax före 4-timmarsinkubationen vid 16 °C och blanda väl.

Felsöka biblioteksförberedelser
Om mer än 10 PCR-cykler behövs eller ingen PCR-produkt kan ses på gel efter PCR-titrering (figur 4), finns det några alternativ för att spara Hi-C-provet. När du arbetar tillbaka från PCR-titreringen är det första alternativet att prova PCR igen. Om det fortfarande inte finns tillräckligt med produkt är det möjligt att prova ytterligare en omgång A-tailing och adapter ligering (steg 3.6) efter att ha tvättat pärlorna två gånger med 1x TLE-buffert. Efter denna ytterligare A-tailing och adapter ligering kan man fortsätta till PCR-titreringen som tidigare. Om det fortfarande inte finns någon produkt är det sista alternativet att resonikera 0,8x-fraktionen från steg 3.3 och fortsätta därifrån.

Begränsningar och fördelar med Hi-C3.0
Det är viktigt att inse att Hi-C är en populationsbaserad metod som fångar den genomsnittliga frekvensen av interaktioner mellan par av loci i cellpopulationen. Vissa beräkningsanalyser är utformade för att skilja kombinationer av konformationer från en population²⁵, men i princip är Hi-C blind för skillnader mellan celler. Även om det är möjligt att utföra encells Hi-C^26,27 och beräkningsinferenser kan göras^28, är encells Hi-C inte lämplig för att erhålla 3C-information med ultrahög upplösning. En ytterligare begränsning av Hi-C är att den bara upptäcker parvisa interaktioner. För att upptäcka multikontaktinteraktioner kan man antingen använda frekventa skärare i kombination med kortläsningssekvensering (Illumina)¹⁶ eller utföra multikontakt 3C²⁹ eller 4C³⁰, med hjälp av långläsningssekvensering från PacBio- eller Oxford Nanopore-plattformar. Hi-C-derivat för att specifikt detektera kontakter mellan och längs systerkromatider har också utvecklats^31,32.

Även om Hi-C¹⁹ och Micro-C³³ kan användas för att generera kontaktkartor vid subkilobasupplösningar, kräver båda en stor mängd sekvensläsningar och detta kan bli ett kostsamt företag. För att komma till liknande eller ännu högre upplösning utan kostnader kan anrikning för specifika genomiska regioner (capture-C 34) eller specifika proteininteraktioner (ChiA-PET 35, PLAC-seq³⁶, Hi-ChIP³⁷) tillämpas. Styrkan och nackdelen med dessa berikningsapplikationer är att endast ett begränsat antal interaktioner samplas. Med sådana anrikningar förloras den globala aspekten av Hi-C (och möjligheten till global normalisering).

Betydelsen och potentiella tillämpningar av Hi-C3.0
Detta protokoll har utformats för att möjliggöra högupplöst, ultradeep 3C samtidigt som det upptäcker storskaliga vikningsfunktioner som TADs och fack¹⁷ (figur 6). Detta protokoll börjar med 5 × 10⁶ celler per rör för varje Hi-C-bibliotek, vilket bör vara mer än tillräckligt med material för att sekvensera en eller två banor på en flödescell för att få upp till 1 miljard parade slutläsningar. För ultradeep-sekvensering bör flera rör med 5 × 10⁶ celler förberedas, beroende på antalet mappade läsningar och PCR-dubbletter. Vid den högsta upplösningen (<1 kb) finns looping-interaktioner mestadels mellan CTCF-webbplatser, men promotor-förstärkarinteraktioner kan också detekteras. Läsare kan hänvisa till Akgol Oksuz et ^al.17 för en detaljerad beskrivning av dataanalysen.

Materials

1 kb Ladder	New England Biolabs	N3232L
Agarose	Invitrogen	16500100
Agencourt AMPure XP magnetic beads , 60 mL	Beckman Coulter	A63881
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit (CFU)	EMD Millipore	UFC500396
Annealing Buffer (5x)	See recipe in supplemental materials
ATP 10 mM	ThermoFisher	R0441
Avanti J-25i High Speed Refrigerated ultra-centrifuge	Beckman Coulter
beckman ultracentrifuge tube 35 mL	Beckman Coulter	357002
Binding Buffer (2x)	See recipe in supplemental materials
biotin-14-dATP 0.4 mM	Invitrogen	19524-016
BSA 10 mg/mL	New England Biolabs	B9000S	dilute from 20 mg/mL
Cell scraper	Falcon	353089
Cell scraper	Corning	3008
Conical polypropylene tubes 50 mL	Denville	C1062-P
Conical tube 15 mL	Denville	C1017-P
Covaris micro tube AFA fiber with snap-cap 130 µL	Covaris	520045/520077
Covaris Sonicator	Covaris	E220/E220evolution/M220
Culture flask 175 cm2	Falcon	353112
Culture plates 150 mm x 25 mm	Corning	430599
dATP 1 mM	Invitrogen	56172
dATP 10 mM	Invitrogen	56172
dCTP 10 mM	Invitrogen	56173
DdeI	New England Biolabs	R0175L
dGTP 10 mM	Invitrogen	56174
DMSO	Sigma	D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM	Invitrogen	10297117
Dounce homogenizer	DWK Life Sciences	8853010002/8853030002
DPBS	Gibco	14190-144
DpnII	New England Biolabs	R0543M
DSG	ThermoScientific	20593
dTTP 10 mM	Invitrogen	56175
Ethanol 70%	Fisher	A409-4	Diluted from 100%
Ethidium Bromide	Fisher	BP1302-10
Formaldehyde (37%)	Fisher	BP531-500
Gel loading dye (6x )	New England Biolabs	B7024S
Glycine in ultrapure water 2.5 M	Sigma	G8898-1KG
HBSS	Gibco	14025-092
Igepal CA-630 detergent	MP Biomedicals	198596
Klenow DNA polymerase 5 U/µL	New England Biolabs	M0210L
Klenow Fragment 3–>5’ exo-, 5 U/µL	New England Biolabs	M0212L
ligation buffer (10x)	New England Biolabs	B7203S
Liquid nitrogen
LoBind microcentrifuge tube 1.7 mL	Eppendorf	22431021
Low Molecular Weight DNA Ladder	New England Biolabs	N3233L
Lysis buffer	See recipe in supplemental materials
Magnetic Particle separator	ThermoFisher	12321D
Microfuge tubes 1.7 mL	Axygen	MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 beads	Invitrogen	65001
NEBuffer 2.1 (10x)	New England Biolabs	B7002S
NEBuffer 3.1 (10x)	New England Biolabs	B7203S
PBS	Gibco	70013-032
PCR (strip) tubes	Biorad	TBS0201/ TCS0803
PCR thermocycler	Biorad	T100
Pfu Ultra II Buffer (10x)	Agilent		Comes with Pfu Ultra
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Agilent	600674
Phase lock tube 15 mL	Qiagen	129065
Phase lock tubes 2 mL	Qiagen	129056
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Invitrogen	15593-049
Protease inhibitor cocktail	ThermoFisher	78440
Proteinase K in ultrapure water 10 mg/mL	Invitrogen	25530-031
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810R
RNase A, DNase and protease-free 10 mg/mL	Thermo Scientific	EN0531
Rotator	Argos technologies	EW-04397-40 or rocking platform
SDS 1%	Fisher	BP13111
Sodium acetate pH = 5.2, 3 M	Sigma
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704401
T4 DNA ligase 1 U/µL	Invitrogen	100004817
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203L
T4 DNA polymerase	New England Biolabs	M0203L
T4 DNA polymerase 3 U/µL	New England Biolabs	M0203L
T4 ligation buffer (5x)	Invitrogen	Y90001
T4 polynucleotide kinase 10 U/µL	New England Biolabs	M0201L
Tabletop centrifuge	Eppendorf	5425
TBE buffer	See recipe in supplemental materials
Tris Low EDTA Buffer (TLE)	See recipe in supplemental materials
Triton X-100 (10%)	Sigma	93443
Truseq adapter oligos	Integrated DNA Technologies (IDT))	https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry	250 nmole and HPLC purified
Tween 20 detergent	Fisher	9005-64-5
Tween Wash Buffer	See recipe in supplemental materials
Vortex	Scientific Industries	(G560)SI-0236