Vernetzte makroporöse 3D-Gerüste aus Mikrogelstäben
Summary
Mikrogelstäbchen mit komplementären reaktiven Gruppen werden durch Mikrofluidik mit der Fähigkeit hergestellt, sich in wässriger Lösung zu vernetzen. Die anisometrischen Mikrogele klemmen und verbinden sich zu stabilen Konstrukten mit größeren Poren im Vergleich zu sphärischen Systemen. Mit GRGDS-PC modifizierte Mikrogele bilden makroporöse 3D-Konstrukte, die für die Zellkultur verwendet werden können.
Abstract
Ein Zwei-Komponenten-System funktionalisierter Mikrogele aus der Mikrofluidik ermöglicht eine schnelle Verkettung zu makroporösen 3D-Konstrukten in wässrigen Lösungen ohne weitere Zusätze. Die kontinuierliche photoinitiierte On-Chip-Gelierung ermöglicht die Variation des Mikrogel-Aspektverhältnisses, das die Bausteineigenschaften für die erhaltenen Konstrukte bestimmt. Glycidylmethacrylat (GMA) oder 2-Aminoethylmethacrylat (AMA) Monomere werden in das Mikrogelnetzwerk auf Basis von Polyethylenglykol (PEG) Sternpolymeren einpolymerisiert, um entweder Epoxid- oder Aminfunktionalität zu erreichen. Ein fokussierender Ölstrom wird in die mikrofluidische Auslassstruktur eingeführt, um eine kontinuierliche Erfassung der funktionalisierten Mikrogelstäbe zu gewährleisten. Basierend auf einer aktuellen Publikation führen Mikrogel-Stäbchen-basierte Konstrukte zu größeren Poren von mehreren hundert Mikrometern und gleichzeitig zu einer insgesamt höheren Gerüststabilität im Vergleich zu einem sphärischen Modell. Auf diese Weise ist es möglich, höhervolumige Konstrukte mit mehr freiem Volumen herzustellen und gleichzeitig den Materialbedarf zu reduzieren. Die miteinander verketteten makroporösen Gerüste können ohne Beschädigung oder Zerfall aufgenommen und transportiert werden. Amin- und Epoxidgruppen, die nicht an der Vernetzung beteiligt sind, bleiben aktiv und können unabhängig voneinander für die Nachmodifikation verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Herstellung von Mikrogelstäbchen zu makroporösen, miteinander verbundenen Gerüsten, die für nachfolgende Zellexperimente verwendet werden können.
Introduction
Um komplexes kooperatives Zellverhalten in 3D-Konstrukten zu untersuchen, müssen Gerüstplattformen eine konsistente Leistung in der Reproduzierbarkeit aufweisen, eine geeignete Geometrie für die Zellmigration aufweisen und gleichzeitig eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Parameteränderung zulassen, um ihren Einfluss auf das lebende Gewebe zu untersuchen1. In den letzten Jahren hat sich das Konzept der makroporösen geglühten Partikel (MAP), das erstmals von Segura et al. beschrieben wurde, zu einer effizienten und vielseitigen Plattform für die 3D-Gerüstherstellung entwickelt2. Die maßgeschneiderte Zusammensetzung der Mikrogele, die die Bausteine des endgültigen 3D-Gerüsts sind, definiert Eigenschaften wie die Steifigkeit des Konstrukts, die selektive chemische Reaktivität des Gelnetzwerks und die endgültige Porengröße des Gerüsts 2,3,4,5,6 vor. Zelladhäsive Peptide als Hinweise für Gerüst-Zell-Interaktionen werden in das Polymernetzwerk der Mikrogele eingebaut, um die Zellbindung zu ermöglichen, und können variiert werden, um ihre spezifischen Auswirkungen auf Zellen in Kultur zu untersuchen. Die 3D-Gerüste werden durch Verkettung der geglühten injizierbaren Mikrogele durch kovalente oder supramolekulare Bindungen stabilisiert, was zu robusten und definierten Konstrukten für die Zellkultur 2,3,5,7,8 führt.
Die Mikrofluidik hat sich als eine der genauesten und anpassungsfähigsten Methoden zur Herstellung definierter granularer Hydrogele etabliert9. Die Möglichkeit, größere Mengen der benötigten Bausteine in einem kontinuierlichen Prozess unter Beibehaltung ihrer chemischen, mechanischen und physikalischen Monodispersität herzustellen, trägt wesentlich zur Eignung dieses Verfahrens bei. Darüber hinaus kann die Größe und Form der hergestellten Mikrogele durch verschiedene Verfahren wie Chargenemulsionen, Mikrofluidik, Lithographie, elektrodynamisches Spritzen oder mechanische Fragmentierung manipuliert werden, die die Geometrie der Bausteine und damit die 3D-Struktur des endgültigen Gerüstsbestimmen 1,10.
Kürzlich wurde über das Konzept makroporöser 3D-Gerüste berichtet, die aus funktionalisierten Mikrogelstäbchen bestehen, die sich schnell in wässrigen Lösungen ohne weitere Zusätze vernetzen11. Die Anisotropie von Mikrogelstäbchen führte zu höheren Porositäten und Porenverteilungen mit größeren Porengrößen im Vergleich zur Verwendung kugelförmiger Mikrogele in dieser Studie11. Auf diese Weise erzeugt weniger Material größere Poren mit einer Vielzahl unterschiedlicher Porengeometrien, während die Stabilität des 3D-Gerüsts erhalten bleibt. Das System besteht aus zwei Arten von Mikrogelstäbchen mit komplementären funktionellen primären Amin- und Epoxidgruppen, die innerhalb der Verkettungsreaktion verbraucht werden, wenn sie miteinander in Kontakt kommen. Die funktionellen Gruppen, die nicht am Verkettungsprozess beteiligt sind, bleiben aktiv und können für die selektive Nachmodifikation mit zelladhäsiven Peptiden oder anderen bioaktiven Faktoren verwendet werden. Fibroblastenzellen heften, verbreiten und vermehren sich, wenn sie in den 3D-Gerüsten kultiviert werden, wachsen zuerst auf der Mikrogeloberfläche und füllen die meisten Makroporen nach 5 Tagen. Eine vorläufige Kokulturstudie an humanen Fibroblasten und humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) zeigte vielversprechende Ergebnisse für die Bildung gefäßartiger Strukturen innerhalb der miteinander verbundenen 3D-Gerüste11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einer der kritischen Schritte in diesem Protokoll ist die Qualität des 2-Aminoethylmethacrylats (AMA), das als Comonomer für die primäre Aminfunktionalisierung verwendet wird. Das AMA sollte ein feinkörniges und vorzugsweise farbloses Pulver sein, das in einem gasdichten Braunglasbehälter geliefert wird. Man sollte die Verwendung von grünlichem und klumpigem Material vermeiden, da es die Gelierungsreaktion erheblich beeinträchtigt und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse negativ beeinflusst. Bei schlechter Gelier…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Koautoren unserer früheren Arbeit, auf der diese Methodik basiert, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born und Tamás Haraszti. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung im Rahmen der Projekte B5 und C3 SFB 985 “Funktionelle Mikrogele und Mikrogelsysteme”. Wir erkennen die Förderung durch den Wettbewerbsausschuss der Leibniz-Senatsverwaltung (SAW) im Rahmen des Professorinnenprogramms (SAW-2017-PB62: BioMat) an. Wir bedanken uns herzlich für die Finanzierung durch die Europäische Kommission (EUSMI, 731019). Diese Arbeiten wurden unter anderem am Center for Chemical Polymer Technology (CPT) durchgeführt, das von der EU und dem Land Nordrhein-Westfalen gefördert wurde (Förderung EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
Referências
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