Высокоскоростное сечение височной кости человека для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха
Summary
В этой статье описывается метод быстрого среза височной кости человека, который использует микропилу с двумя алмазными лезвиями для создания тонких срезов для быстрой декальцинации и анализа иммуногистохимии височной кости.
Abstract
Гистопатологический анализ височных костных отделов человека является фундаментальной методикой изучения патологии внутреннего и среднего уха. Срезы височной кости получают путем посмертного забора височной кости, фиксации, декальцификации, встраивания и окрашивания. Из-за плотности височной кости декальцинация является трудоемким и ресурсоемким процессом; полная подготовка тканей может занять в среднем 9-10 месяцев. Это замедляет исследования отопатологии и препятствует чувствительным ко времени исследованиям, таким как те, которые имеют отношение к пандемии COVID-19. В данной работе описывается методика быстрой подготовки и декальцификации височных костных срезов для ускорения обработки тканей.
Височные кости были собраны посмертно с использованием стандартных методов и зафиксированы в 10% формалине. Прецизионная микропила со сдвоенными алмазными лезвиями использовалась для резки каждой секции на три толстых участка. Толстые висовидные участки кости затем декальцифицировали в декальцифицирующем растворе в течение 7-10 дней, прежде чем были встроены в парафин, разделены на тонкие (10 мкм) участки с использованием криотома и установлены на незаряженных слайдах. Затем образцы тканей депарафинизировали и регидратировали для окрашивания антителами (ACE2, TMPRSS2, Furin) и визуализировали. Эта методика сократила время от сбора урожая до анализа тканей с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Высокоскоростное срезание височной кости может увеличить скорость исследований отопатологии и уменьшить ресурсы, необходимые для подготовки тканей, а также облегчить чувствительные ко времени исследования, такие как те, которые связаны с COVID-19.
Introduction
Исследование височной кости человека предоставляет бесценный ресурс для изучения патологии и патофизиологии внутреннего и среднего уха. До 19-го века мало что было известно об отологических заболеваниях 1,2,3. Чтобы лучше понять отологические заболевания и «спасение слуховой хирургии от рук шарлатанов», Джозеф Тойнби (1815-1866) разработал методы изучения гистологических участков височной кости человека3. Эта работа была продолжена Адамом Политцером (1835-1920) в Вене и других странах Европы в течение оставшейся части 19-го века, который использовал срезы височной кости для описания гистопатологии многих распространенных состояний, влияющих на ухо 2,3,4.
Первая лаборатория височной кости человека в США была открыта в 1927 году в больнице Джона Хопкинса, где Стейси Гильд (1890-1966) разработала методыразрезания височной кости 5,6. Методы, разработанные Гильдией, состояли из 9-10-месячного процесса, который включал в себя посмертный сбор, фиксацию, декальцинацию в азотной кислоте, обезвоживание в этаноле, встраивание целлоидина, секционирование, окрашивание и монтаж. Модификации этой техники были позже сделаны Гарольдом Шукнехтом (1917-1996)7; однако основные компоненты этого процесса остаются практически неизменными.
Значительные ресурсы, необходимые для поддержания лаборатории височной кости, представляли собой проблему для исследования височной кости и, вероятно, способствовали снижению ее популярности за последние 30 лет 4,8. Значительная часть лабораторных ресурсов височной кости должна быть направлена на 9-10-месячный процесс подготовки височной кости. Одним из самых трудоемких этапов подготовки является декальцификация височной кости, которая является самой плотной костью в организме человека. Декальцинация обычно выполняется в азотной кислоте или этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) и занимает от нескольких недель до нескольких месяцев, требуя частой смены растворов 7,9. Кроме того, чувствительные ко времени исследования человеческого уха, такие как те, которые связаны с пандемией COVID-19, могут быть затруднены этим медленным процессом подготовки. В этой статье описывается метод высокоскоростного сечения височной кости, который использует алмазную микропилу для создания толстых участков, которые позволяют быстро декальцинировать и анализировать ткани в течение 10-14 дней после сбора височной кости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование височной кости человека имеет решающее значение для изучения патологии внутреннего и среднего уха, но остается трудоемким и ресурсоемким делом. В этой статье описывается метод, который использует алмазную микропилу для создания толстых височных участков кости, которые м…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мохамеда Лехара за его помощь в этом проекте. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Referências
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
