Höghastighets mänsklig temporal bensektion för bedömning av COVID-19-associerad mellanörspatologi
Summary
Denna artikel beskriver en teknik för snabb mänsklig temporal bensektionering som använder en mikrosåg med dubbla diamantblad för att generera tunna skivor för snabb avkalkning och analys av temporal benimmunhistokemi.
Abstract
Histopatologisk analys av mänskliga temporala bensektioner är en grundläggande teknik för att studera inre och mellanörats patologi. Temporala bensektioner framställs genom temporal benskörd efter döden, fixering, avkalkning, inbäddning och färgning. På grund av det temporala benets densitet är avkalkning en tidskrävande och resurskrävande process; fullständig vävnadsberedning kan ta 9-10 månader i genomsnitt. Detta bromsar otopatologisk forskning och hindrar tidskänsliga studier, såsom de som är relevanta för COVID-19-pandemin. Detta dokument beskriver en teknik för snabb beredning och avkalkning av temporala bensektioner för att påskynda vävnadsbehandling.
Temporala ben skördades postmortem med hjälp av standardtekniker och fixerades i 10% formalin. En precisionsmikrosåg med dubbla diamantblad användes för att skära varje sektion i tre tjocka sektioner. Tjocka temporala bensektioner avkalkades sedan i avkalkningslösning i 7-10 dagar innan de inbäddades i paraffin, delades i tunna (10 μm) sektioner med hjälp av ett kryotom och monterades på oladdade bilder. Vävnadsprover deparaffiniserades sedan och rehydrerades för antikroppsfärgning (ACE2, TMPRSS2, Furin) och avbildades. Denna teknik minskade tiden från skörd till vävnadsanalys från 9-10 månader till 10-14 dagar. Höghastighets temporal bensektionering kan öka hastigheten på otopatologisk forskning och minska de resurser som krävs för vävnadsberedning, samtidigt som de underlättar tidskänsliga studier som de som är relaterade till COVID-19.
Introduction
Mänsklig temporal benforskning ger en ovärderlig resurs för att studera patologin och patofysiologin i inner- och mellanörat. Före 19-talet var lite känt om otologisk sjukdom 1,2,3. För att bättre förstå otologisk sjukdom och “rädda ljudkirurgi från händerna på kvacksalvare” utvecklade Joseph Toynbee (1815-1866) metoder för att studera histologiska delar av det mänskliga temporala benet3. Detta arbete främjades av Adam Politzer (1835-1920) i Wien och andra över hela Europa under resten av 19-talet, som använde temporala bensektioner för att beskriva histopatologin för många vanliga tillstånd som påverkar örat 2,3,4.
Det första mänskliga temporala benlaboratoriet i USA öppnades 1927 på Johns Hopkins Hospital, där Stacy Guild (1890-1966) utvecklade metoder för temporal bensnittning 5,6. Metoderna som utvecklades av Guild bestod av en 9-10 månaders process som inkluderade skörd efter döden, fixering, avkalkning i salpetersyra, uttorkning i etanol, celloidinbäddning, sektionering, färgning och montering. Modifieringar av denna teknik gjordes senare av Harold Schuknecht (1917-1996)7; De grundläggande komponenterna i denna process förblir emellertid väsentligen oförändrade.
De betydande resurser som krävs för att upprätthålla ett temporalt benlaboratorium har inneburit en utmaning för temporal benforskning och sannolikt bidragit till dess minskande popularitet under de senaste 30 åren 4,8. En betydande del av temporala benlaboratoriets resurser måste ägnas åt 9-10 månaders process för temporal benberedning. Ett av de mest tidskrävande stegen i beredningen är avkalkningen av det temporala benet, vilket är det tätaste benet i människokroppen. Avkalkning utförs vanligtvis i salpetersyra eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och tar veckor till månader samtidigt som det kräver frekvent byte av lösningar 7,9. Vidare kan tidskänsliga studier av det mänskliga örat, såsom de som är relaterade till COVID-19-pandemin, hindras av denna långsamma förberedelseprocess. Detta dokument beskriver en teknik för höghastighets temporal bensektionering som använder en diamantmikrosåg för att generera tjocka sektioner som möjliggör snabb avkalkning och vävnadsanalys inom 10-14 dagar efter tidsmässig benskörd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mänsklig temporal benforskning är avgörande för att studera inre och mellanörats patologi men är fortfarande en tids- och resurskrävande strävan. Detta papper beskriver en teknik som använder en diamantmikrosåg för att generera tjocka temporala bensektioner som snabbt kan avkalkas innan ytterligare sektionering så att tiden från vävnadsskörd till studie kan minskas från 9-10 månader till 10-14 dagar. Denna teknik kan minska de resurser som krävs för temporal benbehandling och underlätta tidskänsliga …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mohamed Lehar för hans hjälp med detta projekt. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Referências
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
