Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Summary

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Abstract

A espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) é uma técnica classicamente empregada por químicos e físicos para produzir um sinal coerente de vibrações de assinatura de moléculas. No entanto, essas assinaturas vibracionais também são características de moléculas dentro do tecido anatômico, como o cérebro, tornando-o cada vez mais útil e aplicável para aplicações de Neurociência. Por exemplo, o CARS pode medir lipídios por ligações químicas especificamente excitantes dentro dessas moléculas, permitindo a quantificação de diferentes aspectos do tecido, como a mielina envolvida na neurotransmissão. Além disso, em comparação com outras técnicas tipicamente usadas para quantificar a mielina, o CARS também pode ser configurado para ser compatível com técnicas de imunofluorescência, permitindo a co-marcação com outros marcadores, como canais de sódio ou outros componentes da transmissão sináptica. As alterações da mielinização são um mecanismo inerentemente importante em doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla ou outras condições neurológicas, como a Síndrome do X Frágil ou os transtornos do espectro do autismo, é uma área emergente de pesquisa. Em conclusão, o CARS pode ser utilizado de maneiras inovadoras para responder a questões prementes em Neurociência e fornecer evidências de mecanismos subjacentes relacionados a muitas condições neurológicas diferentes.

Introduction

Os potenciais de ação são a unidade básica de informação no cérebro, e a propagação do potencial de ação através dos axônios constitui um pilar do processamento da informação ^1,2,3. Os neurônios normalmente recebem entradas aferentes de vários outros neurônios e integram essas entradas dentro de uma determinada janela de tempo estreita ^4,5. Portanto, os mecanismos de propagação do potencial de ação nos axônios têm recebido uma quantidade significativa de atenção dos pesquisadores.

Ao se pro....

Protocol

Todos os experimentos cumpriram todas as leis aplicáveis, diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Anschutz.

1. Animais

1. Use camundongos C57BL/6J (estoque #000664) (Mus musculus ) obtidos do Laboratório Jackson ou gerbilos mongóis (Meriones unguiculatus) originalmente obtidos do rio Charles.

2. Preparação de tecidos

1. Para perfusão transcárdica, overdose de espécies de roedores de interesse com pentobarbital (120 mg/kg de peso corpora....

Results

Uma das maiores vantagens da microscopia CARS em relação a outras técnicas é a compatibilidade com imagens fluorescentes²³. A Figura 1 mostra os espectros CARS em comparação com o Nissl marcado com marcador imunofluorescente mostrando pouca ou nenhuma sobreposição nos espectros. A Figura 2 ilustra a configuração do laser para o CARS em combinação com a microscopia confocal. A Figura 3 demonstra duas imagens r.......

Discussion

Um crescente corpo de literatura enfatiza o papel da mielina na função cerebral 13,16,21,28. Além disso, sabemos que a espessura da mielinização e o padrão de mielinização podem mudar em várias condições neurológicas, como esclerose múltipla (revisada em²⁹), envelhecimento (revisada em^{30), autismo 20,31} e muitas .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestésico:
1 mL seringa descartável com agulha 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Surgery:
Spring Scissors - 8mm Ferramentas	de Ciência Fina	15024-10
Pinças padrão	Fine Science Tools	11027-12
Perfusion:
4% Paraformaldeído	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Tesouras Finas - Sharp	Ferramentas de Fine Science	14063-11
Kelly hemostats	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2O
Ponta da agulha, 23 GA x 1"	BD deslizamento de precisão	305193
Solução salina tamponada com fosfato (PBS):
Cloreto de potássio	Sigma	P9333
Bomba monobase de fosfato de potássio	Sigma	P5655
com fluxo variável ou equivalente
Cloreto de sódio	Fisher Chemical	s271-1
Fosfato de sódio dibásico	Sigma	S7907
Dissecação: frasco de
50 mL com 4% PFA
Colher Química Bochem 180mm	Bochem	230331000
Tesoura Fina - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15011-12
Par de pinças finas (Graefe)	Fine Science Tools	11050-10
Bandeja rasa de vidro ou plástico, aproximadamente 10" x 10"
Pinças padrão Tesoura Cirúrgica	Fine Science Tools	11027-12
- Blunt	Fine Science Ferramentas	14000-20
Fatiamento:
Agar, planta	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
placa de	poço Alkali Sci.	TPN1048-NT
strong>Coloração:
AB Meio:			1n 1.000 mL de Millipore H2O
Tamponado com fosfato (PB):
Fosfato de potássio Monobase	Sigma	P5655
Fosfato de sódio Dibásico	Sigma	S7907
BSA (Albumina de soro bovino)	Sigma life science	A2153-100g
Cloreto de Sódio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE  Picoemerald laser	Física de Picoesmeralda & Elektronik
Filtro passa-banda GmbH (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
(500-530 nm)	passa-banda Chroma Technology HQ515/30m-2P
(640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscópio confocal	Olympus	FV1000
Pipeta de transferência de corte	Fisher	13-711-7M
longpass dicróico 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
longpass dicróico 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
shortpass dicróico 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
prato de cultura com fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C
peso do vidro (10 mm x 10 mm haste boro)	Allen Scientific Filtro de
680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS