Udvidelse af forståelsen af tumormikromiljøet ved hjælp af massespektrometribilleddannelse af formalinfaste og paraffinindlejrede vævsprøver
Summary
I en tid med kræftimmunterapi er interessen for at belyse tumormikromiljødynamikken steget markant. Denne protokol beskriver en massespektrometribilleddannelsesteknik med hensyn til dens farvnings- og billeddannelsestrin, som giver mulighed for stærkt multiplekset rumlig analyse.
Abstract
Fremskridt inden for immunbaserede terapier har revolutioneret kræftbehandling og forskning. Dette har udløst stigende efterspørgsel efter karakterisering af tumorimmunlandskabet. Selvom standard immunhistokemi er egnet til at studere vævsarkitektur, er den begrænset til analysen af et lille antal markører. Omvendt kan teknikker som flowcytometri evaluere flere markører samtidigt, selvom information om vævsmorfologi går tabt. I de senere år er multiplexede strategier, der integrerer fænotypisk og rumlig analyse, opstået som omfattende tilgange til karakterisering af tumorimmunlandskabet. Heri diskuterer vi en innovativ teknologi, der kombinerer metalmærkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri med fokus på de tekniske trin i analyseudvikling og optimering, vævsforberedelse og billedoptagelse og -behandling. Før farvning skal et metalmærket antistofpanel udvikles og optimeres. Dette hi-plex billedsystem understøtter op til 40 metalmærkede antistoffer i en enkelt vævssektion. Bemærk, at risikoen for signalinterferens øges med antallet af markører, der er inkluderet i panelet. Efter paneldesign skal der lægges særlig vægt på metalisotoptildelingen til antistoffet for at minimere denne interferens. Indledende paneltest udføres ved hjælp af en lille delmængde af antistoffer og efterfølgende test af hele panelet i kontrolvæv. Formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssektioner opnås og monteres på guldbelagte dias og farves yderligere. Farvningen tager 2 dage og ligner meget standard immunohistokemisk farvning. Når prøverne er farvet, placeres de i billedoptagelsesinstrumentet. Synsfelter vælges, og billeder hentes, uploades og gemmes. Det sidste trin er billedforberedelse til filtrering og fjernelse af interferens ved hjælp af systemets billedbehandlingssoftware. En ulempe ved denne platform er manglen på analytisk software. De genererede billeder understøttes dog af forskellige beregningspatologisoftware.
Introduction
Betydningen af de mange celletyper omkring klonale tumorpopulationer er et afgørende element i kategoriseringen af carcinogenese. Interessen for at belyse denne tumormikromiljø (TME) sammensætning og interaktioner er steget kontinuerligt efter etableringen af immunbaseret terapi som en del af kræftbehandlingsarsenalet. Derfor er behandlingsstrategier skiftet fra en tumorcentreret tilgang til en TME-centreret1.
Indsatsen for at belyse immuncellernes rolle i tumorovervågning og kræftudvikling er steget markant i de senere år 2,3. I medicinsk forskning opstod en overflod af metoder, herunder cytometribaserede metoder og singleplex- og multiplexbilleddannelsesteknologier, som en del af dette forsøg på at dechiffrere de unikke interaktioner mellem flere elementer af TME’er.
Banebrydende metoder såsom flowcytometri (opfundet i 1960’erne), fluorescensaktiveret cellesortering og massecytometri er primært fokuseret på at identificere og kvantificere TME-komponenter4. Selvom cytometribaserede kvantitative teknikker giver mulighed for immunlandskabsfænotypning, er det umuligt at bestemme den cellulære rumlige fordeling. Omvendt bevarer metoder som standard singleplex immunohistokemi vævsarkitekturen og gør det muligt for forskere at analysere cellulær fordeling, selvom et reduceret antal mål i et enkelt vævsafsnit er en begrænsning af disse metoder 5,6. I løbet af de sidste mange år er multipleksede billeddannelsesteknologier til enkeltcelleopløsning såsom multiplex immunfluorescens, stregkodning af fluorescensbilleddannelse og billeddannelsesmassespektrometri opstået som omfattende strategier til erhvervelse af information om samtidig markørfarvning ved hjælp af det samme vævsafsnit7.
Her præsenterer vi en teknologi, der kobler metalmærkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri og muliggør kvantificering af enkeltcelleopløsning, markør co-ekspression (fænotypning) og rumlig analyse ved hjælp af formalinfikseret, paraffinindlejret (FFPE) og friske frosne (FF) vævsprøver 8,9. FFPE-prøver er de mest anvendte materialer til vævsarkiveringsprøver og repræsenterer en lettere tilgængelig ressource til multipleksede billeddannelsesteknologier end friske frosne prøver10. Derudover giver denne teknologi mulighed for at generhverve billeder måneder efter. Heri diskuterer vi vores farvnings- og billedbehandlingsprotokoller ved hjælp af FFPE-vævsprøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den omfattende belysning af de komplekse, indviklede interaktioner mellem de mange komponenter i en TME forbliver et centralt mål for kræftforskning. Producenter har introduceret adskillige multipleksede assays som en del af denne indsats, især i løbet af de sidste 5 år. Multiplekset rumlig analyse er et alsidigt og kraftfuldt værktøj, der letter samtidig kategorisering af flere mål, samtidig med at strukturel morfologi bevares i tumorprøver. Rumlige analyseteknikker kan udføres ved hjælp af fluorescensbilledd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Don Norwood fra Editing Services, Research Medical Library på MD Anderson for at redigere denne artikel og Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory ved Institut for Translationel Molekylær Patologi ved MD Anderson. Denne publikation resulterede delvist fra forskning lettet af den videnskabelige og økonomiske støtte til Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC), der blev leveret gennem National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) til University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
Referências
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
