Uitbreiding van het begrip van de tumormicro-omgeving met behulp van massaspectrometrie Beeldvorming van formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefselmonsters
Summary
In het tijdperk van kankerimmunotherapie is de interesse in het ophelderen van de micro-omgevingsdynamiek van tumoren opvallend toegenomen. Dit protocol beschrijft een massaspectrometrie beeldvormingstechniek met betrekking tot de kleurings- en beeldvormingsstappen, die een zeer gemultiplexte ruimtelijke analyse mogelijk maken.
Abstract
Vooruitgang in immuungebaseerde therapieën heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling en het onderzoek van kanker. Dit heeft geleid tot een groeiende vraag naar de karakterisering van het tumorimmuunlandschap. Hoewel standaard immunohistochemie geschikt is voor het bestuderen van weefselarchitectuur, is het beperkt tot de analyse van een klein aantal markers. Omgekeerd kunnen technieken zoals flowcytometrie meerdere markers tegelijkertijd evalueren, hoewel informatie over weefselmorfologie verloren gaat. In de afgelopen jaren zijn multiplexstrategieën die fenotypische en ruimtelijke analyse integreren naar voren gekomen als uitgebreide benaderingen van de karakterisering van het tumorimmuunlandschap. Hierin bespreken we een innovatieve technologie die metaalgelabelde antilichamen en secundaire ionenmassaspectrometrie combineert, gericht op de technische stappen in de ontwikkeling en optimalisatie van de test, weefselvoorbereiding en beeldacquisitie en -verwerking. Vóór het kleuren moet een met metaal gelabeld antilichaampaneel worden ontwikkeld en geoptimaliseerd. Dit hi-plex beeldsysteem ondersteunt tot 40 met metaal gelabelde antilichamen in een enkele weefselsectie. Van belang is dat het risico op signaalinterferentie toeneemt met het aantal markers in het paneel. Na het ontwerp van het paneel moet bijzondere aandacht worden besteed aan de toewijzing van de metaalisotoop aan het antilichaam om deze interferentie te minimaliseren. Voorlopige paneltests worden uitgevoerd met behulp van een kleine subset antilichamen en vervolgens testen van het hele paneel in controleweefsels. Formaline-vaste, paraffine-ingebedde weefselsecties worden verkregen en gemonteerd op goudgecoate dia’s en verder gekleurd. De kleuring duurt 2 dagen en lijkt sterk op standaard immunohistochemische kleuring. Zodra monsters zijn gekleurd, worden ze in het beeldacquisitie-instrument geplaatst. Weergavevelden worden geselecteerd en afbeeldingen worden verkregen, geüpload en opgeslagen. De laatste fase is beeldvoorbereiding voor het filteren en verwijderen van interferentie met behulp van de beeldverwerkingssoftware van het systeem. Een nadeel van dit platform is het ontbreken van analytische software. De gegenereerde afbeeldingen worden echter ondersteund door verschillende computationele pathologiesoftware.
Introduction
Het belang van de talrijke celtypen rond klonale tumorpopulaties is een cruciaal element in de categorisering van carcinogenese. De interesse in het ophelderen van deze tumor micro-omgeving (TME) samenstelling en interacties is voortdurend toegenomen na de oprichting van immuungebaseerde therapie als onderdeel van het arsenaal voor kankerbehandeling. Daarom zijn de behandelingsstrategieën verschoven van een tumorcentrische benadering naar een TME-centrischebenadering 1.
Pogingen om de rol van immuuncellen in tumorsurveillance en kankerontwikkeling op te helderen, zijn de afgelopen jaren opvallend toegenomen 2,3. In medisch onderzoek ontstond een overvloed aan methoden, waaronder op cytometrie gebaseerde methoden en singleplex- en multiplex beeldvormingstechnologieën, als onderdeel van deze poging om de unieke interacties van meerdere elementen van TME’s te ontcijferen.
Baanbrekende methoden zoals flowcytometrie (uitgevonden in de jaren 1960), fluorescentie-geactiveerde celsortering en massacytometrie zijn voornamelijk gericht op het identificeren en kwantificeren van TME-componenten4. Hoewel op cytometrie gebaseerde kwantitatieve technieken fenotypering van het immuunlandschap mogelijk maken, is het bepalen van de cellulaire ruimtelijke verdeling onmogelijk. Omgekeerd behouden methoden zoals standaard singleplex immunohistochemie de weefselarchitectuur en stellen onderzoekers in staat om cellulaire distributie te analyseren, hoewel een verminderd aantal doelen in een enkele weefselsectie een beperking van deze methoden is 5,6. In de afgelopen jaren zijn multiplexed imaging-technologieën voor eencellige resolutie zoals multiplex immunofluorescentie, barcoding fluorescentie beeldvorming en imaging massaspectrometrie naar voren gekomen als uitgebreide strategieën voor het verkrijgen van informatie over gelijktijdige markerkleuring met behulp van dezelfde weefselsectie7.
Hier presenteren we een technologie die metaalgelabelde antilichamen en secundaire ionenmassaspectrometrie koppelt en kwantificering van de resolutie van één cel, markerco-expressie (fenotypering) en ruimtelijke analyse mogelijk maakt met behulp van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) en vers bevroren (FF) weefselmonsters 8,9. FFPE-monsters zijn de meest gebruikte materialen voor weefselarchiveringsmonsters en vormen een gemakkelijker beschikbare bron voor multiplexed beeldvormingstechnologieën dan vers ingevroren monsters10. Bovendien biedt deze technologie de mogelijkheid om maanden later opnieuw beelden op te vragen. Hierin bespreken we onze kleurings- en beeldverwerkingsprotocollen met behulp van FFPE-weefselmonsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
De uitgebreide opheldering van de complexe, ingewikkelde interacties tussen de meerdere componenten van een TME blijft een centrale doelstelling van kankeronderzoek. Fabrikanten hebben talloze multiplexed assays geïntroduceerd als onderdeel van deze inspanning, vooral in de afgelopen 5 jaar. Gemultiplexte ruimtelijke analyse is een veelzijdig en krachtig hulpmiddel dat de gelijktijdige categorisatie van verschillende doelen vergemakkelijkt met behoud van structurele morfologie in tumormonsters. Ruimtelijke analysetechni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen Don Norwood van Editing Services, Research Medical Library bij MD Anderson voor het bewerken van dit artikel en het Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory bij de afdeling Translational Molecular Pathology bij MD Anderson. Deze publicatie is deels het resultaat van onderzoek dat werd gefaciliteerd door de wetenschappelijke en financiële steun voor het Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) verstrekt via de National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) aan het Md Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC) van de Universiteit van Texas.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
Referências
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
