Bruke single-worm data for å kvantifisere heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakterielle interaksjoner
Summary
Denne protokollen beskriver en 96-brønns forstyrrelse av individuelle bakteriell koloniserte Caenorhabditis elegans etter kald lammelse og overflatebleking for å fjerne eksterne bakterier. Den resulterende suspensjonen er belagt på agarplater for å muliggjøre nøyaktig kvantifisering av bakteriebelastning i et stort antall individuelle ormer.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans er et modellsystem for vert-mikrobe- og vertsmikrobiom-interaksjoner. Mange studier til dags dato bruker batchfordøyelser i stedet for individuelle ormprøver for å kvantifisere bakteriell belastning i denne organismen. Her argumenteres det for at den store interindividuelle variabiliteten sett i bakteriell kolonisering av C. elegans tarmen er informativ, og at batchfordøyelsesmetoder forkaster informasjon som er viktig for nøyaktig sammenligning på tvers av forhold. Som å beskrive variasjonen som ligger i disse prøvene krever et stort antall individer, etableres en praktisk 96-brønns plateprotokoll for forstyrrelse og kolonibelegg av individuelle ormer.
Introduction
Heterogenitet i vertsmikrobeforeninger observeres allestedsnærværende, og variasjon mellom individer blir i økende grad anerkjent som en medvirkende faktor i prosesser på populasjonsnivå fra konkurranse og sameksistens1 til sykdomsoverføring 2,3,4. I C. elegans har “skjult heterogenitet” innen isogene populasjoner blitt observert gjentatte ganger, med underpopulasjoner av individer som viser forskjellige fenotyper i varmesjokkrespons 5,6, aldring og levetid 7,8,9,10,11, og mange andre aspekter av fysiologi og utvikling12 . De fleste analyser som forsøker å identifisere subpopulasjonsstruktur gir bevis for to underpopulasjoner i eksperimentelle populasjoner av isogene, synkroniserte ormer 5,7,8, selv om andre data antyder muligheten for innenfor populasjonsfordeling av egenskaper i stedet for forskjellige grupper 7,12,13 . Av relevans her observeres betydelig heterogenitet i tarmpopulasjoner selv innenfor isogene populasjoner av ormer kolonisert fra en delt kilde til mikrober 13,14,15,16, og denne heterogeniteten kan skjules av batchfordøyelsesmålingene som er mye brukt 17,18,19,20 for bakteriell kvantifisering i ormen.
Dette arbeidet presenterer data som tyder på et behov for større avhengighet av enkeltormmålinger i vertsmikrobeforening, samt protokoller for å øke nøyaktigheten og gjennomstrømningen i enkeltormforstyrrelser. Disse protokollene er utformet for å lette mekanisk forstyrrelse av et stort antall individuelle C. elegans for kvantifisering av levedyktig bakteriebelastning, samtidig som det gir bedre repeterbarhet og lavere innsats per prøve enn pestlebasert forstyrrelse av individuelle ormer. Et anbefalt tarmrensende trinn, hvor ormer får lov til å mate på varmedrept E. coli før preparatet for forstyrrelse, er inkludert for å minimere bidrag fra nylig inntatt og andre forbigående (ikke-adhered) bakterier. Disse protokollene inkluderer en kaldlammelsesmetode for rengjøring av neglebåndet med en overflateblekemiddelbehandling med lav konsentrasjon; overflatebleking kan brukes som et forberedende trinn i enkeltormforstyrrelser eller som en metode for å forberede levende, eksternt bakteriefrie ormer. Denne overflateblekingsmetoden er tilstrekkelig til å fjerne et bredt spekter av eksterne mikrober, og kald behandling gir et alternativ til konvensjonell levamisolbasert lammelse; mens levamisol vil bli foretrukket for kaldfølsomme eksperimenter, minimerer kald lammelse bidrag til farlige avfallsstrømmer og tillater rask gjenopptakelse av normal aktivitet. Mens den fullstendige protokollen beskriver et laboratorieeksperiment der ormer koloniseres med kjente bakterier, kan prosedyrene for rengjøring av ormer og enkeltormforstyrrelser lett brukes på ormer isolert fra ville prøver eller kolonisert i mikrokosmoseksperimenter. Protokollene beskrevet her produserer levende bakterier ekstrahert fra ormtarmen, egnet for plating og kvantifisering av kolonidannende enheter (CFU) i individuelle ormer; for sekvenseringsbasert intestinal samfunnsanalyse, bør påfølgende cellelyse og nukleinsyreekstraksjonstrinn legges til disse protokollene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenteres data om fordelene med enkeltormskvantifisering av bakteriell belastning i C. elegans, sammen med en 96-brønns forstyrrelsesprotokoll for å muliggjøre rask og konsistent innsamling av store datasett av denne typen. Sammenlignet med eksisterende metoder33 tillater disse protokollene høyere gjennomstrømningsmåling av intestinale mikrobielle samfunn i ormen.
Denne tilnærmingen har plating som et hastighetsbegrensende trinn og er ikke virkelig…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne anerkjenne H. Schulenberg og C. LaRock for deres sjenerøse deling av bakteriestammer som brukes i disse forsøkene. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Emory University og NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
Referências
- Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
- Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
- VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
- Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
- Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
- Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
- Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
- Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
- Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
- Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
- Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
- Scott, E., Holden-Dye, L., O’Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
- Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
- Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans – Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
- Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
- Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
- Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
- Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
- Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
- Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
- Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
- Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).
