यह प्रोटोकॉल बाहरी बैक्टीरिया को हटाने के लिए ठंड पक्षाघात और सतह विरंजन के बाद व्यक्तिगत जीवाणु उपनिवेशित कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के 96-अच्छी तरह से व्यवधान का वर्णन करता है। परिणामस्वरूप निलंबन को बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कीड़े में बैक्टीरिया लोड के सटीक, मध्यम-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए अगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है।
नेमाटोड कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस मेजबान-सूक्ष्मजीव और मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के लिए एक मॉडल प्रणाली है। आज तक के कई अध्ययन इस जीव में बैक्टीरिया के भार को मापने के लिए व्यक्तिगत कृमि नमूनों के बजाय बैच डाइजेस्ट का उपयोग करते हैं। यहां यह तर्क दिया जाता है कि सी एलिगेंस आंत के जीवाणु उपनिवेशण में देखी गई बड़ी अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता जानकारीपूर्ण है, और बैच डाइजेस्ट विधियां उन सूचनाओं को त्याग देती हैं जो स्थितियों में सटीक तुलना के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन नमूनों में निहित भिन्नता का वर्णन करने के लिए बड़ी संख्या में व्यक्तियों की आवश्यकता होती है, व्यक्तिगत कीड़े के विघटन और कॉलोनी चढ़ाना के लिए एक सुविधाजनक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रोटोकॉल स्थापित किया जाता है।
मेजबान-सूक्ष्मजीव संघों में विषमता सर्वव्यापी रूप से देखी जाती है, और व्यक्तियों के बीच भिन्नता को प्रतिस्पर्धा और सह-अस्तित्व1 से रोग संचरण 2,3,4 तक जनसंख्या स्तर की प्रक्रियाओं में योगदान कारक के रूप में तेजी से पहचाना जाता है। एलिगेंस में, आइसोजेनिक आबादी के भीतर “छिपी हुई विषमता” को बार-बार देखा गया है, व्यक्तियों की उप-आबादी गर्मी सदमे प्रतिक्रिया5,6, उम्र बढ़ने और जीवनकाल 7,8,9,10,11, और शरीर विज्ञान और विकास के कई अन्य पहलुओं में अलग-अलग फेनोटाइप दिखाती है12 . अधिकांश विश्लेषण जो उप-जनसंख्या संरचना की पहचान करने का प्रयास करते हैं, आइसोजेनिक, सिंक्रनाइज़ किए गए कीड़े 5,7,8 की प्रयोगात्मक आबादी में दो उप-आबादी के लिए सबूत प्रदान करते हैं, हालांकि अन्य डेटा अलग-अलग समूहों 7,12,13 के बजाय लक्षणों के भीतर-जनसंख्या वितरण की संभावना का सुझाव देते हैं . यहां प्रासंगिकता की, आंतों की आबादी में पर्याप्त विषमता रोगाणुओं13,14,15,16 के साझा स्रोत से उपनिवेशित कीड़े की आइसोजेनिक आबादी के भीतर भी देखी जाती है, और इस विषमता को बैच डाइजेस्ट माप द्वारा छुपाया जा सकता है जो व्यापक रूप से कृमि में जीवाणु परिमाणीकरण के लिए 17,18,19,20 का उपयोग किया जाता है।
यह काम होस्ट-माइक्रोब एसोसिएशन में एकल-कृमि माप पर अधिक निर्भरता की आवश्यकता का सुझाव देने वाले डेटा प्रस्तुत करता है, साथ ही एकल-कृमि व्यवधान में सटीकता और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करता है। इन प्रोटोकॉल को व्यवहार्य जीवाणु भार की मात्रा का ठहराव के लिए बड़ी संख्या में व्यक्तिगत सी एलिगेंस के यांत्रिक व्यवधान की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि व्यक्तिगत कीड़े के मूसल-आधारित व्यवधान की तुलना में प्रति नमूना बेहतर पुनरावृत्ति और कम प्रयास प्रदान करता है। एक अनुशंसित आंत-शुद्धिकरण कदम, जहां कीड़े को गर्मी से मारे गए ई कोलाई पर भोजन करने की अनुमति दी जाती है व्यवधान की तैयारी से पहले, हाल ही में निगला और अन्य क्षणिक (गैर-पालन) बैक्टीरिया से योगदान को कम करने के लिए शामिल किया गया है। इन प्रोटोकॉल में कम एकाग्रता सतह ब्लीच उपचार के साथ छल्ली की सफाई के लिए एक ठंड-पक्षाघात विधि शामिल है; सतह विरंजन का उपयोग एकल-कृमि व्यवधान में प्रारंभिक चरण के रूप में या जीवित, बाहरी रूप से रोगाणु मुक्त कीड़े तैयार करने के लिए एक विधि के रूप में किया जा सकता है। यह सतह-विरंजन विधि बाहरी रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को हटाने के लिए पर्याप्त है, और ठंड उपचार पारंपरिक लेवामिसोल-आधारित पक्षाघात का विकल्प प्रदान करता है; जबकि लेवामिसोल को ठंड-संवेदनशील प्रयोगों के लिए पसंद किया जाएगा, ठंड पक्षाघात खतरनाक अपशिष्ट धाराओं में योगदान को कम करता है और सामान्य गतिविधि को तेजी से फिर से शुरू करने की अनुमति देता है। जबकि पूर्ण प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला प्रयोग का वर्णन करता है जहां कीड़े ज्ञात बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित होते हैं, कीड़े और एकल-कृमि व्यवधान की सफाई के लिए प्रक्रियाओं को आसानी से जंगली नमूनों से अलग कीड़े पर लागू किया जा सकता है या सूक्ष्म ब्रह्मांड प्रयोगों में उपनिवेशित किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कृमि आंत से निकाले गए जीवित बैक्टीरिया का उत्पादन करते हैं, जो व्यक्तिगत कीड़े में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की चढ़ाना और मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त हैं; अनुक्रमण आधारित आंतों के सामुदायिक विश्लेषण के लिए, बाद में सेल लिसिस और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण कदम इन प्रोटोकॉल में जोड़ा जाना चाहिए।
एलिगेंस में बैक्टीरिया लोड के एकल-कृमि मात्रा का ठहराव के फायदों पर डेटा प्रस्तुत किया जाता है, साथ ही इस प्रकार के बड़े डेटा सेटों के तेजी से और लगातार अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए 96-अच्छी तरह से व?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु उपभेदों के उदार साझाकरण के लिए एच शुलेनबर्ग और सी लारॉक को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को एमोरी विश्वविद्यालय और एनएसएफ (पीएचवाई 2014173) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |