Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche
Summary
Questo protocollo descrive un’interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello per le interazioni ospite-microbo e ospite-microbioma. Molti studi fino ad oggi utilizzano digest batch piuttosto che singoli campioni di vermi per quantificare la carica batterica in questo organismo. Qui si sostiene che la grande variabilità inter-individuale osservata nella colonizzazione batterica dell’intestino di C. elegans è informativa e che i metodi di digestione batch scartano le informazioni che sono importanti per un confronto accurato tra le condizioni. Poiché la descrizione della variazione inerente a questi campioni richiede un gran numero di individui, viene stabilito un comodo protocollo a piastre a 96 pozzetti per l’interruzione e la placcatura della colonia di singoli vermi.
Introduction
L’eterogeneità nelle associazioni ospite-microbo è osservata ovunque e la variazione tra gli individui è sempre più riconosciuta come un fattore che contribuisce ai processi a livello di popolazione dalla competizione e coesistenza1 alla trasmissione della malattia 2,3,4. In C. elegans, “eterogeneità nascosta” all’interno di popolazioni isogeniche è stata osservata ripetutamente, con sottopopolazioni di individui che mostrano fenotipi distinti nella risposta allo shock termico 5,6, invecchiamento e durata della vita 7,8,9,10,11 e molti altri aspetti della fisiologia e dello sviluppo12 . La maggior parte delle analisi che tentano di identificare la struttura della sottopopolazione forniscono prove di due sottopopolazioni in popolazioni sperimentali di vermi isogenici e sincronizzati 5,7,8, sebbene altri dati suggeriscano la possibilità di distribuzioni all’interno della popolazione di tratti piuttosto che gruppi distinti 7,12,13 . Di rilevanza qui, l’eterogeneità sostanziale nelle popolazioni intestinali è osservata anche all’interno di popolazioni isogeniche di vermi colonizzati da una fonte condivisa di microbi 13,14,15,16, e questa eterogeneità può essere nascosta dalle misurazioni del digest batch che sono ampiamente utilizzate 17,18,19,20 per la quantificazione batterica nel verme.
Questo lavoro presenta dati che suggeriscono la necessità di una maggiore dipendenza dalle misurazioni a singolo worm nell’associazione ospite-microbo, nonché dai protocolli per aumentare l’accuratezza e il throughput nell’interruzione del singolo worm. Questi protocolli sono progettati per facilitare l’interruzione meccanica di un gran numero di singoli C. elegans per la quantificazione della carica batterica vitale, fornendo al contempo una migliore ripetibilità e uno sforzo inferiore per campione rispetto all’interruzione basata sui parassiti dei singoli vermi. Una fase raccomandata di spurgo intestinale, in cui i vermi sono autorizzati a nutrirsi di E. coli ucciso dal calore prima della preparazione per l’interruzione, è inclusa per ridurre al minimo i contributi di batteri recentemente ingeriti e altri batteri transitori (non aderenti). Questi protocolli includono un metodo di paralisi a freddo per la pulizia della cuticola con un trattamento di candeggina superficiale a bassa concentrazione; lo sbiancamento superficiale può essere utilizzato come fase preparatoria nella distruzione di un singolo verme o come metodo per preparare vermi vivi e privi di germi esternamente. Questo metodo di sbiancamento superficiale è sufficiente per rimuovere una vasta gamma di microbi esterni e il trattamento a freddo fornisce un’alternativa alla paralisi convenzionale basata sul levamisolo; mentre il levamisolo sarà preferito per gli esperimenti sensibili al freddo, la paralisi a freddo riduce al minimo i contributi ai flussi di rifiuti pericolosi e consente una rapida ripresa della normale attività. Mentre il protocollo completo descrive un esperimento di laboratorio in cui i vermi sono colonizzati con batteri noti, le procedure per la pulizia dei vermi e l’interruzione del verme singolo possono essere prontamente applicate a vermi isolati da campioni selvatici o colonizzati in esperimenti di microcosmo. I protocolli qui descritti producono batteri vivi estratti dall’intestino del verme, adatti per la placcatura e la quantificazione di unità formanti colonie (CFU) in singoli vermi; per l’analisi della comunità intestinale basata sul sequenziamento, a questi protocolli devono essere aggiunte successive fasi di lisi cellulare e di estrazione dell’acido nucleico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui vengono presentati i dati sui vantaggi della quantificazione a verme singolo della carica batterica in C. elegans, insieme a un protocollo di interruzione a 96 pozzi per consentire l’acquisizione rapida e coerente di grandi set di dati di questo tipo. Rispetto ai metodi esistenti33, questi protocolli consentono una misurazione a più alto rendimento delle comunità microbiche intestinali nel verme.
Questo approccio ha la placcatura come un passaggio limitan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare H. Schulenberg e C. LaRock per la loro generosa condivisione di ceppi batterici utilizzati in questi esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti della Emory University e NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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