이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.
선충류 Caenorhabditis elegans 는 숙주 – 미생물 및 숙주 – 미생물 상호 작용을위한 모델 시스템입니다. 현재까지 많은 연구는이 유기체의 박테리아 부하를 정량화하기 위해 개별 웜 샘플보다는 배치 다이제스트를 사용합니다. 여기서 C. elegans 장의 박테리아 식민지화에서 볼 수있는 큰 개인 간 변동성은 유익하며, 배치 소화 방법은 조건 간 정확한 비교에 중요한 정보를 폐기한다고 주장합니다. 이러한 샘플에 내재 된 변형을 설명하는 것은 많은 수의 개인을 필요로하기 때문에 개별 웜의 파괴 및 콜로니 도금을위한 편리한 96 웰 플레이트 프로토콜이 확립됩니다.
숙주-미생물 연관성에서의 이질성은 유비쿼터스적으로 관찰되며, 개인들 사이의 변이는 경쟁과 공 존1에서 질병 전달 2,3,4에 이르는 집단 수준 과정에 기여하는 요인으로 점점 더 인식되고 있다. C. elegans에서, isogenic 집단 내의 “숨겨진 이질성”이 반복적으로 관찰되었으며, 열 충격 반응 5,6, 노화 및 수명 7,8,9,10,11 및 생리학 및 발달의 많은 다른 측면에서 뚜렷한 표현형을 보이는 개인의 하위 집단 12 . 하위 집단 구조를 확인하려는 대부분의 분석은 동종 동기화 된 웜5,7,8의 실험 집단에서 두 개의 하위 집단에 대한 증거를 제공하지만, 다른 데이터는 별개의 그룹보다는 형질의 인구 내 분포의 가능성을 시사합니다 7,12,13 . 여기서와 관련성이 있는 경우, 미생물 13,14,15,16의 공유 공급원으로부터 콜로니화된 웜의 isogenic 집단 내에서도 장 집단에서의 실질적인 이질성이 관찰되며, 이러한 이질성은 웜의 박테리아 정량화를 위해 널리 사용되는 배치 다이제스트 측정치(17,18,19,20)에 의해 은폐될 수 있다.
이 연구는 숙주-미생물 연관에서 단일 웜 측정에 대한 의존도가 높아질 필요성을 시사하는 데이터와 단일 웜 중단에서 정확도와 처리량을 높이기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 생존 가능한 박테리아 부하의 정량화를 위해 많은 수의 개별 C. elegans 의 기계적 파괴를 촉진하도록 설계되었으며, 개별 웜의 유역 기반 파괴보다 샘플 당 더 나은 반복성과 낮은 노력을 제공합니다. 벌레가 파괴를 준비하기 전에 열로 죽인 대장균 을 먹일 수 있도록 허용하는 권장 장 정화 단계가 포함되어 최근에 섭취 한 박테리아 및 기타 일시적 (부착되지 않은) 박테리아의 기여를 최소화합니다. 이들 프로토콜은 저농도 표면 표백제 처리로 큐티클을 세척하기 위한 냉 마비 방법; 표면 표백은 단일 웜 파괴의 준비 단계 또는 살아있는 외부 세균이없는 웜을 준비하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 이러한 표면-표백 방법은 광범위한 외부 미생물을 제거하기에 충분하며, 냉간 처리는 종래의 레바미솔-기반 마비에 대한 대안을 제공한다; 레바미솔은 감기에 민감한 실험에 선호되는 반면, 냉간 마비는 위험한 폐기물 흐름에 대한 기여를 최소화하고 정상적인 활동을 신속하게 재개 할 수있게합니다. 전체 프로토콜은 웜이 알려진 박테리아로 식민지화되는 실험실 실험을 설명하지만, 웜 및 단일 웜 파괴를 청소하는 절차는 야생 샘플에서 분리되거나 소우주 실험에서 식민지화 된 웜에 쉽게 적용될 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 웜 장에서 추출 된 살아있는 박테리아를 생산하며, 개별 웜에서 콜로니 형성 단위 (CFU)의 도금 및 정량화에 적합합니다. 시퀀싱 기반 장 군집 분석을 위해, 후속 세포 용해 및 핵산 추출 단계가 이들 프로토콜에 추가되어야 한다.
여기서 데이터는 C. elegans의 박테리아 부하의 단일 웜 정량화의 이점과 96-well 파괴 프로토콜에 대해 제시되어 이러한 유형의 대규모 데이터 세트를 신속하고 일관되게 수집 할 수 있습니다. 기존의 방법(33)과 비교하여, 이들 프로토콜은 웜 내의 장내 미생물 군집의 더 높은 처리량 측정을 허용한다.
이 접근법은 도금을 속도 제한 단계로 가지며 진정한 …
The authors have nothing to disclose.
저자들은 H. Schulenberg와 C. LaRock이이 실험에 사용 된 박테리아 균주를 관대하게 공유 한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 Emory University와 NSF (PHY2014173)의 기금으로 지원되었습니다.
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |