JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Использование данных об одном черве для количественной оценки гетерогенности в caenorhabditis elegans-бактериальных взаимодействиях

Published: July 22, 2022
doi:
10.3791/64027
, ,
1Department of Biology,Emory University, 2Department of Physics,Emory University

Summary

Этот протокол описывает 96-луночное нарушение отдельных бактериально колонизированных Caenorhabditis elegans после холодного паралича и поверхностного обесцвечивания для удаления внешних бактерий. Полученная суспензия наносится на агаровые пластины, чтобы обеспечить точную, среднепроизводительную количественную количественную оценку бактериальной нагрузки у большого количества отдельных червей.

Abstract

Нематода Caenorhabditis elegans является модельной системой для взаимодействия хозяин-микроб и хозяин-микробиом. Многие исследования на сегодняшний день используют периодические дайджесты, а не отдельные образцы червей для количественной оценки бактериальной нагрузки в этом организме. Здесь утверждается, что большая межиндивидуальная изменчивость, наблюдаемая при бактериальной колонизации кишечника C. elegans , является информативной, и что методы периодического переваривания отбрасывают информацию, которая важна для точного сравнения между условиями. Поскольку описание вариаций, присущих этим образцам, требует большого количества особей, установлен удобный протокол плиты из 96 скважин для разрушения и покрытия колоний отдельных червей.

Introduction

Гетерогенность в ассоциациях хозяин-микроб наблюдается повсеместно, и различия между индивидуумами все чаще признаются в качестве фактора, способствующего процессам на уровне популяции от конкуренции и сосуществования1 до передачи болезни 2,3,4. У C. elegans «скрытая гетерогенность» в изогенных популяциях наблюдалась неоднократно, причем субпопуляции особей демонстрировали различные фенотипы в реакции теплового шока 5,6, старении и продолжительности жизни 7,8,9,10,11 и многих других аспектах физиологии и развития12. . Большинство анализов, которые пытаются идентифицировать субпопуляционную структуру, дают доказательства для двух субпопуляций в экспериментальных популяциях изогенных, синхронизированных червей 5,7,8, хотя другие данные предполагают возможность внутрипопуляционного распределения признаков, а не отдельных групп 7,12,13 . Здесь уместно отметить, что существенная гетерогенность в кишечных популяциях наблюдается даже в пределах изогенных популяций червей, колонизированных из общего источника микробов 13,14,15,16, и эта неоднородность может быть скрыта измерениями периодического переваривания, которые широко используются 17,18,19,20 для количественной оценки бактерий у червя.

В этой работе представлены данные, свидетельствующие о необходимости большей зависимости от измерений одного червя в ассоциации между хозяином и микробом, а также протоколов для повышения точности и пропускной способности при нарушении работы одного червя. Эти протоколы предназначены для облегчения механического разрушения большого количества отдельных C. elegans для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки, обеспечивая при этом лучшую повторяемость и более низкое усилие на образец, чем разрушение отдельных червей на основе пестика. Рекомендуемый этап очистки кишечника, на котором червям разрешается питаться убитой теплом кишечной палочкой до подготовки к нарушению, включен для минимизации вклада недавно проглоченных и других переходных (неприлипших) бактерий. Эти протоколы включают метод холодного паралича для очистки кутикулы с низкоконцентрированной поверхностной отбеливающей обработкой; Поверхностное отбеливание может быть использовано в качестве подготовительного этапа при разрушении одиночных червей или в качестве метода подготовки живых, внешне свободных от микробов червей. Этот метод поверхностного отбеливания достаточен для удаления широкого спектра внешних микробов, а холодная обработка обеспечивает альтернативу обычному параличу на основе левамизола; в то время как левамизол будет предпочтительным для экспериментов, чувствительных к холоду, холодный паралич сводит к минимуму вклад в потоки опасных отходов и позволяет быстро возобновить нормальную деятельность. В то время как полный протокол описывает лабораторный эксперимент, в котором черви колонизируются известными бактериями, процедуры очистки червей и разрушения одного червя могут быть легко применены к червям, выделенным из диких образцов или колонизированным в экспериментах с микромиром. Протоколы, описанные здесь, производят живые бактерии, извлеченные из кишечника червя, пригодные для покрытия и количественной оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) у отдельных червей; для анализа кишечного сообщества на основе секвенирования к этим протоколам следует добавить последующие этапы лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот.

Protocol

Черви, используемые в этих экспериментах, были получены из Генетического центра Caenorhabditis , который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Бристоль N2 относится к дикому типу. Мутанты DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) и daf-2(e1370) III (CGC CB1370) исполь?…

Representative Results

Отбеливающая стерилизация живых червейПоверхностно обесцвеченные черви эффективно свободны от внешних бактерий до тех пор, пока подвижность не вернется и выделение не возобновится. В условиях, используемых здесь, наблюдается быстрое вымирание бактерий в буфер?…

Discussion

Здесь представлены данные о преимуществах количественной оценки бактериальной нагрузки у C. elegans одним червем, а также протокола разрушения 96 скважин, позволяющего быстро и последовательно получать большие наборы данных этого типа. По сравнению с существующими методами3…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Х. Шуленберга и К. ЛаРока за их щедрое совместное использование бактериальных штаммов, используемых в этих экспериментах. Эта работа была поддержана финансированием Университета Эмори и NSF (PHY2014173).

Materials

96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O’Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans – Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Keywords: Caenorhabditis ElegansBacterial InteractionsSingle-worm DataMechanical Disruption96-well FormatMedium ThroughputQuantificationWorm MeasurementsM9TX01OP50SDS/DTT SolutionChemical PermeabilizationWorm Cuticle
check_url/pt/64027?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image