Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

Summary

Le tractus gastro-intestinal est l’un des organes les plus sensibles aux blessures lors des traitements radiothérapeutiques contre le cancer. C’est à la fois un système d’organes avec l’une des capacités de régénération les plus élevées à la suite de telles insultes. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Abstract

L’épithélium intestinal est constitué d’une seule couche de cellules, mais contient plusieurs types de cellules différenciées en phase terminale, qui sont générées par la prolifération active de cellules souches intestinales situées au fond des cryptes intestinales. Cependant, lors d’événements de lésions intestinales aiguës, ces cellules souches intestinales actives subissent la mort cellulaire. L’irradiation gamma est un traitement du cancer colorectal largement utilisé qui, bien qu’efficace sur le plan thérapeutique, a pour effet secondaire d’épuiser le pool de cellules souches actives. En effet, les patients souffrent fréquemment d’un syndrome de radiation gastro-intestinale pendant la radiothérapie, en partie en raison de l’épuisement actif des cellules souches. La perte de cellules souches intestinales actives dans les cryptes intestinales active un pool de cellules souches intestinales de réserve typiquement quiescentes et induit une dédifférenciation des cellules précurseurs sécrétoires et entérocytaires. Sans ces cellules, l’épithélium intestinal n’aurait pas la capacité de se remettre de la radiothérapie et d’autres agressions tissulaires majeures. De nouvelles avancées dans les technologies de traçage de lignée permettent de suivre l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération et ont été utilisées avec succès pour étudier cela dans l’intestin. Cette étude vise à décrire une méthode d’analyse des cellules de l’épithélium intestinal de la souris à la suite d’une lésion radiologique.

Introduction

L’épithélium intestinal humain couvrirait approximativement la surface d’un demi-terrain de badminton s’il était placé complètement à plat¹. Au lieu de cela, cette couche cellulaire unique séparant les humains du contenu de leurs intestins est compactée en une série de projections, de villosités et d’indentations en forme de doigts, des cryptes qui maximisent la surface des intestins. Les cellules de l’épithélium se différencient le long d’un axe crypte-villosités. Les villosités sont principalement constituées d’entérocytes absorbant les nutriments, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus et de cellules entéroendocrines productrices d’hormones, tandis que les cryptes sont principalement constituées de cellules de Paneth productrices de défensine, de cellules souches actives et de réserve et de cellules progénitrices 2,3,4,5. De plus, la communication bidirectionnelle de ces cellules avec les cellules stromales et immunitaires du compartiment mésenchymateux sous-jacent et le microbiote de la lumière génère un réseau complexe d’interactions qui maintient l’homéostasie intestinale et est essentiel à la récupération après une blessure ^6,7,8.

L’épithélium intestinal est le tissu qui s’auto-renouvelle le plus rapidement dans le corps humain, avec un taux de renouvellement de 2-6 jours 9,10,11. Au cours de l’homéostasie, les cellules souches actives à la base des cryptes intestinales (cellules cylindriques de la base cryptique), marquées par l’expression du récepteur couplé à la protéine G 5 (LGR5) riche en protéines répétées et riche en leucine, se divisent rapidement et fournissent des cellules progénitrices qui se différencient en toutes les autres lignées épithéliales intestinales. Cependant, en raison de leur taux mitotique élevé, les cellules souches actives et leurs progéniteurs immédiats sont particulièrement sensibles aux lésions par rayonnement gamma et subissent une apoptose après irradiation 5,12,13,14. Lors de leur perte, les cellules souches de réserve et les cellules non souches (sous-population de progéniteurs et certaines cellules différenciées en phase terminale) au sein des cryptes intestinales subissent une activation et reconstituent le compartiment de la crypte basale, qui peut alors reconstituer les populations cellulaires des villosités et, ainsi, régénérer l’épithélium^{intestinal 15}. En utilisant des techniques de traçage de la lignée, plusieurs groupes de recherche ont démontré que les cellules souches de réserve (quiescentes) sont capables de soutenir la régénération lors de la perte de cellules souches actives 13,16,17,18,19,20,21,22. Ces cellules sont caractérisées par la présence de l’oncogène de la protéine 1 du complexe polycomb (Bmi1), du gène de la transcriptase inverse de la télomérase de souris (mTert), de l’homéobox du houblon (Hopx) et du gène de la protéine 1 répétitive riche en leucine (Lrig1). En outre, il a été démontré que les cellules non souches sont capables de reconstituer les cryptes intestinales en cas de lésion 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particulier, il a été démontré que les progéniteurs des cellules sécrétoires et des entérocytes subissent une dédifférenciation lors d’une blessure, redeviennent des cellules souches et favorisent la régénération de l’épithélium intestinal. Des études récentes ont identifié des cellules exprimant plusieurs marqueurs qui possèdent la capacité d’acquérir des caractéristiques de type souche en cas de blessure (telles que DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1⁺)^{32,33,34,35,36}. Étonnamment, Yu et al. ont montré que même les cellules de Paneth matures (LYZ ⁺) peuvent contribuer à la régénération intestinale³⁷. De plus, en plus de provoquer l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et de perturber la fonction de barrière épithéliale, l’irradiation entraîne une dysbiose de la flore intestinale, l’activation des cellules immunitaires et l’initiation d’une réponse pro-inflammatoire, ainsi que l’activation des cellules mésenchymateuses et stromales^38,39.

Le rayonnement gamma est un outil thérapeutique précieux dans le traitement du cancer, en particulier pour les tumeurs colorectales⁴⁰. Cependant, l’irradiation affecte de manière significative l’homéostasie intestinale en induisant des dommages aux cellules, ce qui conduit à l’apoptose. L’exposition aux rayonnements provoque de multiples perturbations qui ralentissent le rétablissement d’un patient et est marquée par des lésions muqueuses et une inflammation dans la phase aiguë et de la diarrhée, de l’incontinence, des saignements et des douleurs abdominales à long terme. Cette panoplie de manifestations est appelée toxicité des rayonnements gastro-intestinaux. De plus, la progression radio-induite de la fibrose transmurale et/ou de la sclérose vasculaire peut ne se manifester que des années après le traitement^38,41. Simultanément à la blessure elle-même, le rayonnement induit une réponse de réparation dans les cellules intestinales qui active les voies de signalisation responsables de l’initiation et de l’orchestration de la régénération⁴². La maladie de l’intestin grêle radio-induite peut provenir d’une radiothérapie pelvienne ou abdominale administrée à d’autres organes (comme le col de l’utérus, la prostate, le pancréas, le rectum)^{41,43,44,45,46}. Les lésions par irradiation intestinale constituent donc un problème clinique important, et une meilleure compréhension de la physiopathologie qui en résulte est susceptible de faire progresser le développement d’interventions visant à atténuer les complications gastro-intestinales associées à la radiothérapie. Il existe d’autres techniques qui permettent d’étudier le but régénérateur de l’épithélium intestinal en dehors de la radiation. Des modèles murins transgéniques et chimiques pour étudier l’inflammation et la régénération par la suite ont été développés⁴⁷. Le sulfate de sodium de dextrane (DSS) induit une inflammation dans l’intestin et conduit au développement de caractéristiques similaires à celles de la maladie inflammatoire de l’intestin⁴⁸. Une combinaison de traitement DSS avec le composé pro-cancérogène azoxyméthane (OMA) peut entraîner le développement d’un cancer associé à la colite^48,49. Les lésions induites par la reperfusion ischémique sont une autre méthode utilisée pour étudier le potentiel de régénération de l’épithélium intestinal. Cette technique nécessite de l’expérience et des connaissances chirurgicales⁵⁰. En outre, les techniques susmentionnées causent différents types de lésions que les rayonnements et peuvent entraîner l’implication de différents mécanismes de régénération. De plus, ces modèles prennent beaucoup de temps, alors que la technique de rayonnement est assez brève. Récemment, des méthodes in vitro utilisant des entéroïdes et des colonoïdes générés par l’intestin et le côlon ont été utilisées en combinaison avec des lésions radiologiques pour étudier les mécanismes de la régénération intestinale^51,52. Cependant, ces techniques ne récapitulent pas complètement l’organe qu’elles modélisent^53,54.

Le protocole présenté comprend la description d’un modèle murin de lésion par rayonnement gamma en combinaison avec un modèle génétique qui, après un traitement au tamoxifène, permet de retracer les lignées provenant de la population de cellules souches de réserve (Bmi1-Cre^ER; Rosa26^eYFP). Ce modèle utilise une irradiation totale du corps de 12 Gy, qui induit des lésions intestinales suffisamment importantes pour activer les cellules souches de réserve tout en permettant l’étude ultérieure de la capacité de régénération intestinale dans les 7 jours suivant la lésion⁵⁵.

Protocol

Toutes les souris ont été hébergées dans la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) de l’Université Stony Brook. Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stony Brook a approuvé toutes les études et procédures impliquant des sujets animaux. Les expériences impliquant des sujets animaux ont été menées en stricte conformité avec le protocole approuvé de manipulation des animaux (IACUC #245094). NOTE: Les souches de souris B…

Representative Results

L’utilisation de l’irradiation totale du corps (TBI) de 12 Gy en combinaison avec le traçage génétique murin de la lignée permet une analyse approfondie des conséquences des lésions radiologiques dans l’intestin. Pour commencer, Bmi1-CreER; Les souris Rosa26eYFP ont reçu une seule injection de tamoxifène, ce qui induit une expression améliorée de la protéine fluorescente jaune (EYFP) au sein d’une population de cellules souches de réserve Bmi1+ . Deux jours ap…

Discussion

Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il permet l’analyse précise des changements dans l’épithélium intestinal au cours des 7 jours suivant la blessure. Il est important de noter que les points temporels sélectionnés reflètent les étapes cruciales de la lésion et sont caractérisés par des altérations distinctes de l’intestin (phases de lésion, d’apoptose, de régénération et de normalisation)⁶⁰. Ce modèle d’irradiation a été ?…

Materials

1 mL syringe	BD	309659	–
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight	VWR	20068-630	–
27G x 1/2" needle	BD	305109	–
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe	Covidien	1188128012	–
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)	Santa Cruz Biotechnology	sc284628A	10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	22-026-213	–
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	The Jackson Laboratory	Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J	The Jackson Laboratory	Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock	Millipore-Sigma	3116956001
Chicken anti-GFP	Aves	GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen	Thermo Fisher Scientific	C10638	–
Corn oil	Millipore-Sigma	C8267	–
Decloaking Chamber	Biocare Medical	DC2012	–
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100	light sensitive
DNase-free proteinase K	Invitrogen	C10618H	diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155
DPBS	Fisher Scientific	21-031-CV	–
Eosin	Fisher Scientific	S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X	Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Millipore-Sigma	F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor	Best Theratronics Ltd.	–	0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3	Millipore-Sigma	GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific	Fisher Scientific	23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)	Thermo Fisher Scientific	H3569	dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-603-252	–
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)	Millipore-Sigma	11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	L119-500	0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL	VWR	89215-218	–
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398	–
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade	Capitol Scientific	AAP-281000ACSCSLT	–
Rabbit anti-Ki67	BioCare Medical	CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium	Fisher Scientific	22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree	Fisher Scientific	50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit	VWR	25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
Tamoxifen	Millipore-Sigma	T5648	30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle	Sakura	4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades	Sakura	4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura	4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid	Sakura	4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid	Sakura	4457
Tween 20	Millipore-Sigma	P7949
Unisette Processing Cassettes	VWR	87002-292	–
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-081
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL